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    食用菌种的分离和培养技术介绍

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        在自然界里,食用菌都不是单独存在的,而是和许多细菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。所谓菌种分离,就是把这些和食用菌一起生活的杂菌分离出来,通过培养,获得纯的优良菌种。菌种分母种、原种、栽培种。制种程序可参考 图13。
       
        (一)母种的分离培养
        食用菌母种的分离,可分为孢子分离法、组织分离法以及基内菌丝分离等。
       
        1.孢子分离法
        孢子分离法,是用食用菌的有性孢子或无性孢子萌发成菌丝,培养成菌种的方法。这种菌种生活力较强,但孢子个体之间有差异,且自然分化现象较严重,变异大,需经出菇试验才能在生产上应用。
        (l)单孢分离法:是每次或每支试管只取一个担孢子, 让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的方法。蘑菇和草菇用单孢分离得到的菌丝,有结实能力,可采用此法分离生产纯菌种。单孢分离生产上较少采用,而且技术复杂,一般采用多孢分离法。
        (2)多孢分离法:就是把许多孢子接种在同一培养基上,让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法。具体操作方法,有以下几种:
        ①种菇孢子弹射法:选择个体健壮、朵形圆正,无病虫害、出菇均匀、高产稳产,适应性强的八九分成熟的种菇,切去大部分,菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。在接种箱或无菌室内,把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面,漏斗倒盖在培养皿上面;上端小孔用棉花塞住。培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上,静置12~20小时,菌褶上的孢子就会散落在培养皿内。形成一层粉末状孢子印(平菇极淡紫色,蘑菇、草菇 为褐色,香菇、金针菇孢子印白色)。用接种针沾取少量孢子在试管中的琼脂外面或培养皿上划线接种。待孢子萌发,生成菌落时,选孢子萌发早、长势好的菌落进行试管培养。
        还可用孢子采集器收集孢子。方法是选好种菇后,按上述程序,轻轻掀开玻璃钟罩,将种菇柄朝下插在孢子采收器的钢丝架上,放在培养皿正中央。随即盖好玻璃罩,用纱布将钟掌周围塞好。并在纱布上倒少许升汞或无菌水。移入 20℃左右恒温箱培养。
        ②褶上涂抹法:按无菌操作分离时;应选择成熟的种菇,用接种针直接插入褶片之间,轻轻抹取褶片表面子实体尚未弹射的孢子,再在培养基上划线接种。
        ③钩悬法:取成熟菌盖的几片菌褶或一小块耳片(黑木耳、毛木耳、白木耳〕,用无菌不锈钢丝(或铁丝、棉线等其他悬挂材料)悬挂于三角瓶内的培养基的上方,勿使接触到培养基或四周瓶壁。置适宜温度下培养、转接即可。
        ④贴附法:按无菌操作将成熟的菌褶或耳片取一小块, 用溶化的琼脂培养基或阿拉伯胶、浆糊等贴附在配管斜面培养基正上方的试管壁上。经6~12小时的培养,待孢子落在斜面上,立即把孢子连同部分琼脂培养基移植到新的试管中培养即可。
        孢子分离得到的母种、必须进一步提纯复壮,当母种定植一星期左右,菌丝布满斜面时,选择菌丝健壮、生长旺盛无老化、无感染杂茵的母种试管,进而转管扩大,一般到栽培种,转管不宜超过5次。
        孢子分离得到的母种,必须通过出菇试验,鉴定为优质菌种后,才可供生产使用。
        一般菌类如蘑菇、平菇、凤尾菇、香菇、冬菇和草菇等,都可用多孢分离法获得母种。
        现就银耳孢子分离略述于下:
        按无菌操作获取种耳后,悬挂种耳的三角瓶经12小时培养后,瓶底培养基表面就有"孢子印"。取出种耳,置 20℃—25℃温箱培养2~3天,培养基表面会出现乳白色透明的糊状小菌落,就是银耳的酵母状分生孢子形成的少量银耳菌丝。此时移接入试管斜面培养基上,待长满斜面后,再移接入营养丰富,且表面比较干燥的培养基上。经30天左右,菌落长出白色菌丝。
        银耳的酵母状分生孢子、菌丝只有与羽毛状菌丝的子囊菌(香灰菌丝)混合培养时,由后者帮助分解木材及其他一些纤维物质,提供营养,才能利于银耳孢子萌发,菌丝的定植和子实体的形成。
        在两种菌丝交会时,先选出两种纯菌丝。
        羽毛状菌丝要纯化选育,一般要选取生长迅速,爬壁力强的试管斜面或种瓶,取先端菌丝,转管移接,置25℃—28℃上培养,重复转管几次即可得到优良纯种。
        银耳菌丝的特点,菌丝生长缓慢,担孢子也不易萌发。在进行两菌混合时,先取经8~IO天培养的银耳菌丝斜面,按无菌操作方法在该斜面上距银耳菌丝约0.5厘米处接入一 小块羽毛状菌丝。置25℃下培养1周即得到混合好的银耳母种。

        2.组织分离培养法
        利用子实体内部组织,进行无性繁殖而获得母种的简便方法,即组织分离。该法操作简便,菌丝生长发育快,品种特性易保存下来,特别是杂交育种后,优良菌株用组织分离法能使遗传特性稳定下来。常采用以下分离方法。
        (l)子实体分离:种菇要选朵大盖厚,柄短,八九分成熟的优良品种。切去菇两基部,在无菌箱内以0.1%的升汞水浸几分钟,再用无菌水冲洗并揩干或用75%酒精棉球擦拭菌盖与菌柄2次,进行表面消毒。接种时,只要将种菇撕开,在萌盖和菌柄交界处或菌褶处,挑取一小块组织;移接 到PDA培养基上。置25℃左右温度下培养3-5天,就可以看到组织上产生白色绒毛状菌丝,转管扩大即得到菌种。如香菇、平菇等可以用此方法。
        (2)菌核分离:茯苓、猪苓、雷丸等菌的子实体不易采集。而常见的是它贮藏营养的菌核。用菌核分离,同样可以获得菌种。方法是将菌核表面洗净,用酒精或升汞消毒后,切开菌核,取中间组织一小块,约黄豆大小,接种在PDA 培养基斜面上,保温培养。应注意的是,菌核是贮藏器官,大部分是多糖类物质,只含有少量的菌丝,因此挑取的组织块要大一些,如果组织块过小,则不易分出菌种。
        (3)菌素分离:有一部分子实体不易找到,也没有菌核,可以用菌素进行分离。如蜜环菌、假蜜环菌。其操作方法是先用酒精或升汞将菌素表面黑色皮层轻轻擦拭2~3次, 然后去掉黑色外皮层(菌鞘),抽出白色菌髓部分;用无菌剪刀将菌髓剪一小段,接种在培养基上,保温培养,即得该菌菌种。
        菌素分离要注意:因菌素比较细小,分离素也比较细小,分离时极易污染杂菌,所以要严格操作。 

        3.基内菌丝分离培养法
        利用食用菌生育的基质作为分离材料,来得到纯菌种的一种方法,叫基内菌丝分离法。
        此种分离方法是适宜只有在特定的季节才出现,而且是朝生暮死,不易采得的子实体。基内分离法与组织分离法不同之点是,干燥的菇木或耳木中的菌丝常呈休眠状态。接种后有时并不立刻恢复生长。因此,有必要保留较长的时间(约1个月),以断定菌丝是否能成活。基内菌丝分离法又可分为,材中菌丝分离(即菇木或耳木分离法)及土中菌丝分离法等。
        (1)材中菌丝分离法:就是菇木或耳木分离法,为了减少杂菌的感染,菇(耳)木在分离之前,必须进行无菌处理。可以把菇(耳)水表面用酒精灯火焰轻轻烧过,以烧死霉菌的孢子,或再用0.1%的升汞水浸孢几分钟,然后用无菌水冲洗后用无菌滤纸吸干。接种块切取时应注意。接种块必须在该菌菌丝分布的范围内切取。所以,菌丝生长缓慢的种类应浅取;菌种生长快的种类可以深取。同时。还应根据菇菌的种类、木材质地、菇(耳)木粗细、发育时间的长短来确定菌丝分布的范围。然后用一把利刀进行切取。接种块应尽量小些,以减少杂菌感染机会,提离菌种的纯度。接种块移到培养基上,就应该放到适合菌丝生长的22℃~26℃ 的温室或温箱中培养,使菌丝恢复生长。 

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