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    微生物菌种的保藏

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        菌种的衰退与复壮

        1.衰退:
        菌种在培养或保藏过程中,由于自发突变的存在,出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象,称为菌种的衰退。
         衰退的原因:①基因突变,②分离现象。

        常见的衰退现象:
        菌落和细胞形态的改变;
        生长速度缓慢,产孢子越来越少;
        抵抗力、抗不良环境能力减弱等。
        代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降。

        2、 菌种的复壮:
          使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下,通过纯种分离和生产性能测定等方法,从衰退的群体中找出未衰退的个体,以达到恢复该菌原有典型性状的措施;广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作,以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变(正变)不断地从生产中选种。

        菌种的复壮措施:
        纯种分离:(平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等); 通过寄主体内生长进行复壮(如Bacillus thuringiensis的复壮) ; 淘汰已衰退的个体(采用比较激烈的理化条件进行处理,以杀死生命力较差的已衰退个体);采用有效的菌种保藏方法。

        3、防止菌种衰退的方法:
        控制传代次数(一般在DNA的复制过程中,碱基的错配率是5×10-4,自发突变的频率为10-8~10-9,采用良好的菌种保藏方法,可以减少移种和传代的数);选择合适的培养条件;采用不同类型的细胞进行传代(对丝状微生物而言,通常采用稳定的单核孢子进行接种);采用有效的菌种保藏方法。

        菌种保藏

        优良的菌种,如保管不好,就会发生生活力减弱,杂菌污染等情况。因此,如何能长期保持菌种优良的特性,不致衰老和断种,是很重要的工作。下面介绍的是微生物菌种的保藏方法,食用菌菌种的保藏可以借鉴之:

        由于微生物具有容易变异的特性,因此,在保藏过程中,必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态,即达到半休眠或完全休眠的状态,使之在一定的时间内不发生变异而又保持生活能力,从而达到保藏的目的,有的可保藏几十年或更长时间。在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力。

        低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素,所以,菌种保藏方法虽多,但都是根据这三个因素而设计的。

        保藏方法大致可分为以下几种:

        1.传代培养保藏法

        又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等(后者作保藏厌氧细菌用),培养后于4—6℃冰箱内保存。

        2.液体石蜡覆盖保藏法

        是传代培养的变相方法,能够适当延长保藏时间,它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡,一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡,另一方面可阻止氧气进入,以减弱代谢作用。

        3.载体保藏法

        是将微生物吸附在适当的载体,如土壤、沙子、硅胶、滤纸上,而后进行干燥的保藏法,例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。

        4.寄主保藏法

        用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物,如病毒、立克次氏体、螺旋体等,它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代,此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。

        5.冷冻保藏法

        可分低温冰箱(-20—-30℃,-50—-80℃)、干冰酒精快速冻结(约-70℃)和液氮(-196℃)等保藏法。

        6.冷冻干燥保藏法

        先使微生物在极低温度(-70℃左右)下快速冷冻,然后在减压下利用升华现象除去水分(真空干燥)。

        有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液,以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。

        相关器材

        细菌、酵母菌,放线菌和霉菌;

        肉膏蛋白胨斜面培养基,灭菌脱脂牛乳,灭菌水,化学纯的液体石蜡,甘油,五氧化二磷,河沙,瘦黄土或红土,冰块、食盐,干冰,95%酒精,10%盐酸,无水氯化钙;

        灭菌吸管,灭菌滴管,灭菌培养皿,管形安瓿管,泪滴形安瓿管(长颈球形底),40目与 100目筛子,油纸,滤纸条(0.5×1.2cm),干燥器,真空泵,真空压力表,喷灯,L形五通管,冰箱,低温冰箱(-30℃),液氮冷冻保藏器。

        操作步骤、各保藏法的应用范围及其优缺点

        下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。

        1.斜面低温保藏法

        将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上,待菌充分生长后,棉塞部分用油纸包扎好,移至2—8℃的冰箱中保藏。

        保藏时间依微生物的种类而有不同,霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月,移种一次。酵母菌两个月,细菌最好每月移种一次。

        此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法,优点是操作简单,使用方便,不需特殊设备,能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异,因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的,屡次传代会使微生物的代谢改变,而影响微生物的性状;污染杂菌的机会亦较多。

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