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    资料:草菇菌种的提纯复壮初探

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      草菇菌种的提纯复壮初探

      王志强
      上海农科院食用菌所 农业部食用菌遗传育种重点开放试验室 上海市农业遗传育种重点试验室,上海闵行
      《食用菌》2009.6

        菌种的分离与筛选是在食用菌栽培过程中的重中之重。食用菌的菌种在使用过程中存在着变异与退化,尤其是草菇菌丝,生长快退化也快,因此要定期引种或提纯复壮,才能保证菌种质量及种性稳定,从而为最终产量稳定打下基础。

        1  组织分离

        工厂化生产草菇时,为了保证种性稳定,大多采用定期组织分离、严格筛选,获得菌种。一般每次选择种菇时,首先要选择出菇好(产量高,整体菇形大小适中,整齐度高)的菇房,菇房内无明显病虫害;其次在此菇房内选择出菇最好的床架,从该床架中挑选出菇最好的料层;在该料层上最好的一片菇中选择无杂菌虫害、生长健壮、非常结实、底盘肥大的草菇幼菇(五六分熟,呈小水蜜桃状)3~4个。采下幼菇立即放入无菌或洁净的塑料袋中,连同分离用的试管培养基带到菌种室超净工作台。

        组织分离时,先用75%的消毒酒精消毒双手和工具以及种菇表面(操作熟练者也可不消毒种菇表面),用充分灼烧的手术刀先在纵面上浅浅的环切一道(不要切破外菌幕),在种菇的基部从正中切开一个小口,用手捏种菇外部剥开菇蕾,在菇盖与菇柄交界处用灭过菌冷却后的手术刀浅切一个“田”字形,每个小块3~4mm见方(尽量不要划穿菇肉触及菌褶),直接用刀将菌肉小块接入试管培养基上,塞上棉塞。将菌肉小块拍到试管底部,置于29~31℃环境培养。分离到的试管要达到24支左右,如因操作失误而达不到此数量,要补充合格种菇再分离。

        2  分离菌株的鉴定与筛选

        2.1  初筛1 

        ①一般分离培养3d左右菇肉上萌发出白色菌丝,此时挑出因操作不过关而导致斜面感染杂菌的试管,余下继续培养;
        ②待菌丝长至2cm左右时,观察菌丝生长情况:a基内菌丝整齐浓密,纤细有力呈银灰色,生长速度快;气生菌丝爬壁能力强,长势整齐一致的继续培养;b.基内菌丝很稀疏,气生菌丝长势混乱,气生菌丝发白,气生菌丝远比基内苗丝多或者感染杂菌,只要出现其中一种情况就剔除;
        ③观察满管快慢,标注满管时间;
        ④观察厚垣孢子出现早晚,标注时间;优先选择先满管先出现厚垣孢子的试管,留最好的12株,不足则有多少留多少。

        2.2  初筛2 

        ①将剩余的12株编号VZl~VZ12,取尖端菌丝转管,底部3cm不动,每支转20~30支,对应标注VZlMI~VZ12M1;
        ②转管后剩余的菌种,在酒精灯下,敲破试管底部 (可用小砂轮沿底部无培养基处用力划出痕迹,然后在火焰上稍稍烤一下,如未破裂,迅速用冷的酒精棉球冷却可使试管底部破裂),用灭过菌的打孔器在底部1~2cm位置打孔取样(打孔器直径4~5mm),打2排孔,每排2个;靠基部的那排接到平板中央,另一排接到平板边沿;菌丝面贴培养基,标注与转管试管相同,置于29~31℃倒置培养;
        ③转管试管的筛选方式与下述“草菇母种转管筛选”相同;平板分2块:接在中央的菌种,主要对比菌丝形态,色泽、均一度,是否存在角变,淘汰不稳定的菌株;接在边沿的菌株,主要比较每组的平均生长速度,如果平板的盖板无冷凝水的,比较其爬壁力;综合评比后,筛选出最佳的8株。

        2.3  复  筛

        ①待厚垣孢子出现后,将筛选出的8个菌株的试管置于20℃下避光保藏;
        ②8株菌株挑最好的1~2个平板接原种,离接种块2cm处打孔取样,每个样接1袋原种,菌丝面贴料面。每个菌株接30袋,29~31℃避光培养,记录其生长速度、观测菌丝色泽及长势(原种培养基须按配方精确称量,严格控制料水比,拌料均匀,装袋重量、高度、松紧度一致)。
        ③筛选出表现最佳的4个菌株,每个菌株挑最好的20袋原种,5袋置于20℃避光保藏,15袋进行出菇试验。

        3  出菇试验

        出菇试验对于所有食用菌的育种都是最关键的一步,通过出菇试验比较不同菌株之间的优劣,筛选出不同菌株适合的生产模式。

        草菇组织分离平板接原种的同时,外来引种经转管筛选后的母种,每个菌株接30袋原种;当厚垣孢子都出现后,每个菌株挑出较好的15袋做出菇试验。
        ①4个菌株加外来引种各 15袋,每个菌株每组5袋,3个重复;
        ②沿底部折角割去袋底,袋口留2cm,多余割去,排在菇床架上;
        ③喷出菇水:出菇水的温度、pH值与正常出菇水相同,总水量约为原种干重的30%,喷完出菇水后盖无纺布进入催蕾环节;出菇水根据实际情况调节,做到底部不滴水,宁少勿多,防止因水分过多造成大幅度减产。
        ④催蕾及出菇管理与常规同,采收记重时记录每组的采收时间和采收菇重,统计分析时每组剔除1袋最差的,其余统计分析比较平均生物转化率、开始出菇时间和清床时间;保留生物转化率最高、周期最短的2个菌株;淘汰的菌株对应的保藏原种停止保藏,保留的2个菌株对应的保藏原种在有效期内轮流转扩栽培种投人生产。

        4  草菇母种转管筛选

        转管前要将种源在29~31℃的环境下培养24~48h,转管时要做到空白斜面无冷凝水,接种块大小一致,规格3mm×3mm~4mm×4mm,菌种块直接掉到底部,不要在培养基上划过,29~31℃环境下避光培养。
        ①接种后24h,观察萌动情况,正常12h萌动;
        ②接种后48h,观察菌丝生长情况:a基内菌丝整齐浓密,纤细有力呈银灰色,生长速度快;气生菌丝爬壁能力强,长势整齐一致的继续培养;b基内菌丝很稀疏,气生菌丝长势混乱,气生菌丝发白,气生菌丝远比基内菌丝多或者感染杂菌,出现其中一种情况要剔除;c相对a而言,生长速度略慢,标注后对比培养(有些种块在接种时烫伤而萌动慢造成的,后期培养指标合格可以使用);
        ③接种后72h,观察气生菌丝的爬壁能力,将爬壁能力较弱的剔除;
        ④接种后84~120h,正常菌丝满管,比较检查时要将培养不同天数满管的标注并分开(分成3类);培养144h未满管的剔除;
        ⑤接种后156~240h,正常菌丝出现砖红色厚垣孢子,每天检查,出现厚垣孢子后,标注出现日期,当天放置到18~22℃环境避光保存(保藏时将不同天数满管的分开放);培养240h未出现厚垣孢子的剔除。

        注:斜面母种在30d有效保藏期内使用的,对于同一批次同一品种的,优先使用菌丝先长满的;在菌丝同一天长满的里面优先使用先出现厚垣孢子的。

        5  原种和栽培种的筛选

        生产原种和栽培种之前,在接种前48h,取出保藏菌种置于29~31℃下恢复培养。
        原种的筛选标准:以生长速度、菌丝色泽和健壮程度、厚垣孢子出现早晚为基准;采用标准棉子壳配方29~31℃培养,一般48~72h封面,8~10d长满,12~15d出现厚垣孢子,10d内未长满的淘汰;菌丝纤细有力呈银灰色的保留,菌丝变浓白或局部变浓白的的淘汰;由于配方以及含水量的不同,上述参数会有所不同,根据实际情况选择菌丝外观好生长速度快的原种,出现厚垣孢子早的更好。

        栽培种的筛选与原种基本相同,差异在时间上,一般使用标准配方在29~31℃培养,48h封面,7~10d长满,11~14d出现厚垣孢子,10d内未长满的淘汰。

        6  菌种保藏期限

        草菇母种出现厚垣孢子之后立即置于18~22℃环境避光保藏,30d内使用最佳,最长不超过60d,草菇原种出现厚垣孢子之后立即置于18~22℃环境避光保藏,20d内使用;草菇栽培种出现厚垣孢子之后最好立即使用,18~22℃下保藏前3天效果最佳,最多存放7d。

        注意事项:

        ①在草菇上使用的试管培养基,要注意以下几点:
        a.培养基在配制至分装前,做到搅拌均匀,防止因试管内营养差异影响对菌丝优劣的判断;
        b.试管培养基灭菌后冷却、摆斜面时要防止出现大量冷凝水,培养基温度在55~60℃的时候出锅,温度过高冷凝水多,温度过低容易凝固;斜面摆好后要立刻覆盖一些洁净的保温材料,防止凝固时产生大量冷凝水;如果少量定型的斜面存在冷凝水,应剔除;如果大多数试管都产生冷凝水,可在较密闭的干净箱体内放置干燥剂(如生石灰块)对试管进行干燥,待斜面上冷凝水除去后立即停止干燥。
        ②际准草菇菌种配方:棉子壳84%,麸皮12%,轻质碳酸钙2%,生石灰2%,料水比1∶1;灭菌后pH≤6.0。根据棉子壳的质量优劣,酌情添加1%蔗糖。
        ③周期的安排:在各个环节都稳定的情况下,一般组织分离、出菇试验90d做一次,如果出现高产菇房,立即做组织分离和出菇试验。一次组织分离到出菇试验结束需要40d,每次接试管到出现厚垣孢子需要7~10d,每次转管出现厚垣孢子保藏20d需要进行下1次转管(每次转管的尽量在保藏1个月内使用),允许转管3次。

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