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    文献:谈食用菌菌种的保藏

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      作者:刘 红 黄建军 许丽娟 魏小武 《现代农业科技》 2008年第18期

        摘要 对食用菌菌种保藏的目的意义、基本原理、方法及效果鉴定进行了介绍,以便为广大食用菌生产者的菌种保藏工作提供参考。
        关键词 食用菌;菌种保藏;斜面菌种;非斜面固体菌种
        中图分类号 S646.032 文献标识码A文章编号1007-5739(2008)18-0122-02
        
        菌种是国家重要的生物资源,是生产、教学和科学研究的基本材料。食用菌和其他生物一样,具有遗传性和变异性,菌种保藏过程中,不仅要保持菌种不死亡、不被杂菌污染,更主要的是保持菌种遗传性状不发生或尽可能少发生变异。一个优良的食用菌菌种被选育出来以后,必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变,才不至于降低生产性能,才能长期在生产中使用。因此,菌种保藏在食用菌生产上具有重要的意义。为适应群众性生产的需要,使优良高产菌株尽可能长时间地在生产上发挥作用,并降低菌种的衰亡速度,防止杂菌污染,确保菌种的纯正,现对食用菌菌种的保藏做一简介,并介绍几种简单易行、实用效果好的菌种保藏方法。
        
        1 食用菌菌种保藏的目的意义及基本原理
        
        菌种保藏的主要目的在于能在较长时间内保持菌种的生存,保持菌种在遗传、形态和生理上的稳定性。对于生产用的商业品种,就是要保持其生产性状的稳定性。同时,还要保持菌种的物种独立性,即使其免受其他微生物的侵染,保持纯培养状态。因此,它与新品种的选育具有同等的重要性。特别是在目前国内菌种分散生产的情况下,菌种来源不清,菇农之间菌种误传,某些菇农和科研单位毫无根据地命名,使菌种出现同名异物或同物异名的现象,造成了菇农选择菌种的困难。而菌种的保藏和管理有利于这些问题的缓解。
       
        菌种保藏的方法很多,但原理大同小异,均是通过低温、干燥、缺氧和饥饿等手段来达到最大限度降低菌丝体的生理代谢。首先要挑选优良纯菌种,包括菌丝体和它们的孢子;其次,根据其生理、生化特点,人为创造低温、干燥或缺氧等条件,抑制微生物的代谢作用,使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态,从而延长菌种生命以及使菌种保持原有的性状,防止变异。不管采用哪种保藏方法,在菌种保存过程中要求不死亡、不污染杂菌和不退化。
        
        2 食用菌菌种保藏的方法
        
        2.1 试管斜面菌种系列保存方法

        2.1.1 低温定期移植保藏法。将需要保藏的菌种接种在适宜的斜面培养基上,适温培养,当菌丝健壮地长满斜面时取出,放在3~5℃低温干燥处或4℃冰箱中保藏,每隔3~6个月移植转管1次,具体应根据菌种特性决定。保藏时要注意环境湿度不能太高,以防霉菌通过棉塞进入管内。因此,若用棉塞,可用干净的塑料薄膜或牛皮纸包扎棉塞,也可用无菌的白胶塞,并用石蜡涂封,即可减少污染的机会,也可防止培养基干燥。除草菇外,大多食用菌菌种都能采用此法保藏。
       
        2.1.2 液体石蜡保藏法。取化学纯液体石蜡装于三角瓶中高压灭菌后,放入40℃恒温箱中,蒸发其中水分,至石蜡油完全透明为止。将处理好的石蜡油移接在空白斜面上,28~30℃下培养2~3d,证明无杂菌生长方可使用。然后将母种接在斜面培养基上,当菌丝在斜面上生长丰满后,将液体石蜡注在斜面上,注入量以高出斜面1cm为宜,使菌种与空气隔绝,降低其新陈代谢能力。管口用灭过菌的白胶塞塞紧,并用石蜡涂封,直立放在室内干燥处或冰箱内保藏。一般可保存1年以上,在低温下保藏时间还可延长。使用时从斜面上挑取菌丝少许,移接到新鲜斜面培养基上,经培养即可。由于菌丝体沾有液体石蜡而影响其生长,需再经1次移接才能恢复正常生长。
       
        2.1.3 白胶塞封口保存法。选择与试管口径相符的白胶塞,用0.2%煤酚皂溶液洗涤,浸泡在酒精内待用。当试管斜面长满菌丝后,在无菌条件下拔去棉塞,取浸泡的白胶塞1个,通过火焰迅速塞入试管口内,并用石蜡熔封。此法能达到与石蜡油封存相似的效果。用该法保存菌种可存活1~3年,但以每年移植1次为好。
       
        2.1.4 蒸馏水保藏法。将8成熟试管菌种放在接种箱内,注入蒸馏水,将培养基斜面全部淹没至管口2cm。管口用白胶塞塞紧,并用石蜡涂封,常温下置于阴凉处立放,可以保藏1年左右。

        2.2 非斜面固体菌种系列保存法

        2.2.1 麦麸保藏法。将麦麸和水按0.80∶1充分拌匀后,装入试管高压灭菌,经无菌检查合格后接种,适温下培养至菌丝体发育好后,将试管放入真空干燥器内,用真空泵将麦麸培养基内水分抽干,然后移入盛有硅胶的干燥器内,用凡士林密封在常温下保存,可保藏3~5年。

        2.2.2 麦粒保藏法。取优质小麦,淘洗后浸入20℃水中5h,捞出稍晾干,装入试管,占管深1/3,高压灭菌后趁热摇散,冷却后接入菌丝体,适温培养至菌丝长满基质后用石蜡封棉塞,置于冰箱或20℃以下干燥处,可保藏1~2年。
       
        2.2.3 木屑保藏法。将阔叶树木屑78%、麦麸20%、蔗糖1%、石膏粉1%,混合后加水拌匀,装入试管灭菌后,接入斜面菌种,在适温下培养,待菌丝长至试管2/3时用石蜡封棉塞,置低温或常温下保藏,一般可保藏1~ 2年。
       
        2.2.4 稻草粉保存草菇菌种。草菇斜面菌种在2~4℃下保存2d便失去生活力,室温下保存又因斜面培养基失水太快影响菌种存活。用稻草粉保存草菇菌种有其独特的优越性。其配方为稻草粉75%、麦麸22%、石膏粉1%、碳酸钙1%、蔗糖1%、适量的水拌匀调湿。装入试管高压灭菌后按常规接种培养,当菌丝长到试管2/3时,管口棉塞用石蜡熔封。常温下保存至次年,不影响其活力和种性。

        2.3 液体系列菌种保存法

        2.3.1 生理盐水保藏法。将待保藏的菌种接入马铃薯培养液中,在250mL三角形瓶中装60mL培养液,振荡培养或每天摇动5~10次,培养5~7d,然后将形成的菌丝球用无菌吸管吸入装有5mL无菌生理盐水试管中,每管移入4~5个菌丝球,塞上无菌白胶塞,用石蜡涂封,置低温下可保藏1~2年。

        2.3.2 营养液保存法。营养液的配方为马铃薯汁20%、葡萄糖2%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%、硫酸铵微量。每支试管内装5mL,灭菌后用无菌吸管吸取生理盐水保藏法深层培养的菌丝球4~5个于试管中,10~25℃的室温下保存,可存活2~3年,其保存效果优于生理盐水保存法。不影响菌株形成子实体的能力。

        2.3.3 无菌水保存法。先将培养好的斜面菌种切成小块,连同培养基移入盛有适量无菌蒸馏水的试管中,然后用白胶塞封口,在20℃左右的室温下保存。可存活1~2年。也可用磷酸缓冲液做保存液,其缓冲液的pH值视各保存菌株生长的酸碱度而定。该法操作简便易行。

        2.4 利用孢子保存菌种系列方法

        2.4.1 滤纸片保藏法。取白色(收集深色孢子)或黑色(收集白色孢子)滤纸,剪成4.0cm×0.8cm的小纸条,平铺在培养皿中用纸包裹进行灭菌。采用钩悬法收集孢子,让孢子落在滤纸条上。将载有孢子的滤纸条放入保藏试管中,白胶塞封口,再将保藏试管放入干燥器中1~2d,除去滤纸水分,然后低温保藏。保存期可达2~10年。

        2.4.2 沙土管保藏法。取河沙用水浸泡洗涤数次,过60目筛除去粗粒,加用1%稀盐酸煮沸30min,以除去其中的有机质,再用水冲洗至pH值达到中性,烘干备用。同时取非耕作层的瘦黄土或红土,用水反复冲洗至中性,烘干碾细,过100目筛,将处理好的沙与土以2~4∶1混匀,然后分装小试管内,每管装0.5g,高压灭菌(1.5kg/cm2)3次,再干热灭菌(160℃,2h)1次,待无菌检验合格后方可使用。将已形成孢子的斜面菌种,在无菌条件下注入无菌水3mL,刮菌苔,制成菌悬液,再用无菌吸管吸取菌液滴入砂土管中,以浸透砂土为止。将接种后的沙土管放入盛有干燥剂的真空干燥器内,接上真空泵抽气至沙土干燥为止。真空干燥操作需在孢子接入后48h内完成,以免孢子发芽。制备好的沙土管石蜡封口,在低温下可保藏2~10年。

        此外,还有甘油保藏法、枝条保藏法、超低温液氮保藏法、冷冻真空干燥法等。
       
        菌种保藏方法虽多,但都存在一些缺点,需进一步进行研究和探讨。其中低温定期移植保藏法虽然简单易行,不需特殊设备,但需几个月转管1次,转管的次数多了,变异的可能性就增大,易造成菌种衰退。近年来人们找到了一种目前认为最有效广谱安全的保藏方法——超低温液氮保藏法,在ATCC 用这种方法保藏双孢蘑菇,9年后菌种仍保持稳定,用于生产,产量、质量无大变化,是目前国际上公认为较为理想的菌种保藏方法,但用这种方法保藏菌种,需要液氨保藏罐设备,且液氯来源有限,费用高,所以还不能普及推广使用,只有少数科研院所使用。此外,还有冷冻真空干燥法,此法一般可保存10年以上,但成本较高。各菌种保藏中心、科研单位和生产单位可根据本地具体条件与生产实际选用菌种保藏方法,以确保菌种无退化或变异,保证科研、生产的正常进行。
        
        3 菌种保藏效果的鉴定
        
        食用菌菌种保藏效果的鉴定的常用指标是菌株的存活率和接种物成活率。我们认为要确切地判断一个菌株在保藏后是否已发生了变异,仅测菌株的这2项指标是不够的,还必须对其进行全面仔细的连续观察和测定,可从以下4个方面进行考查:①生物学特征,如菌丝形态、颜色等;②对基质分解能力,如走菌、吃料速度等;③遗传特征,如相关酶的酶谱、酶活力等;④生产出菇能力,包括产量、质量。通过经常检验,以确保不出现任何退化迹象的菌株取得菇农的信赖。再者,就菌种保藏本身而言,通过保藏菌种的效果鉴定,可以对保藏方法进行评价,进一步加以改善,使保藏体系更加完善。
        
        4参考文献

        [1] 汪天鹤.《食用菌菌种管理办法》及食用菌菌种种质资源保护生产、经营及质量管理与鉴定及贮藏实用手册[M].北京:中国农业科学出版社,2006.
        [2] 黄日明.食用菌育种栽培加工技术[M].长沙:湖南科学技术出版社,1998.
        [3] 曾辉,王泽生.食用菌菌种保藏研究进展[J].中国食用菌,1994,13(5):5-6.

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