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    食用菌固态菌种生产技术操作规程

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      固态菌种生产技术操作规程

        菌种是食用菌生产的基础,只有优良的菌种才可能有好的收成。菌种一般分为母种、原种或栽培种3级。无论制作哪一级菌种,关键应强调无菌观念,严格按照无菌技术要求进行操作。固态菌种生产技术操作规程如下:

        1、范围

        本标准规定了食用菌菌种的定义、操作规程、菌种质量标准以及标志、贮存、运输。本标准适用于各种食用菌母种、原种、栽培种。

        2、引用标准

        下列标准所包含的条文,通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时,所示版本均为有效,所有标准都会被修订,使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。

        GB/T 12728-91 食用菌术语

        DB33.B39.063-90 食、药用菌菌种质量标准

        
        3、定义

        3.1 母种(一级菌种,俗称试管菌种) 由孢子、子实体组织、耳木或基质菌丝分离纯化,并在琼脂培养基上繁殖的菌种。

        3.2 原种(二级菌种) 由母种移植到固体培养基繁殖的菌种。

        3.3 栽培种(三级菌种,俗称生产种) 由原种移植扩大的菌种。

        3.4 培养基 培养物生长所需营养物质的液体或固体混合物。

        3.5 移植 将菌种从一种基物移接到另外的培养物中扩大培养的过程。

        3.6 接种 将菌种移植在培养基物中的方法。

        3.7 无菌 不含活杂菌体的状态。

        4、菌种操作规程

        4.1 母种操作规程

        母种的制作大致经过以下几个过程:培养基配制→培养基灭菌→子实体分离或耳木分离或孢子分离→培养→转管纯化培养→母种。

        4.1.1 培养基制作 

        根据不同食用菌的不同营养需要配制不同的培养基。常用的配方有:

        ①、土豆葡萄糖琼脂培养基(简称PDA培养基) 土豆(即马铃薯)200克、葡萄糖20克、琼脂(凝固剂)20克。

        ②、土豆蔗糖琼脂培养基(PSA培养基) 土豆200克、琼脂20克、蔗糖20克、水1000毫升。

        ③、土豆胡萝卜琼脂培养基(PCA培养基) 土豆20克、胡萝卜25克、琼脂20克、水1000毫升。

        ④、土豆琼脂培养基(PA培养基) 土豆250—300克、琼脂20克、水1000毫升。 

        4.1.2 容器 试管,试管应保持清洁、干燥、无菌。

        4.1.3 灭菌

        因为自然界里到处有微生物的存在,如空气、所有原料、水以及一切用具和器具的表面,这些微生物对食用菌菌种而言,都属于有害菌,即通常所说的杂菌。我们制作的菌种,要求绝对不能染上杂菌,所以必须进行严格灭菌。常用灭菌方法有:

        ①、高压蒸气灭菌 即用高压灭菌锅,通过加热增加锅内压力,使蒸气温度升高到120℃以上,在短时间内杀死一切微生物和它们的芽抱及抱子。原种用量较栽培种少,一般小批量生产使用这种灭菌方法,灭菌时间在1.5公斤/平方厘米的压力下,维持在0.5~1小时。

        ②、加热灭菌法 近年来普遍使用的一种方法是常压一次灭菌法,所需设备简单、投资少、成本低,适合我国农村使用。此法只要砌一个锅灶,买一口大锅,做几个蒸笼就可以了。把待杀菌的物品放入蒸笼里,从上气开始,保持蒸煮6~8小时,即可达到灭菌的目的。

        ③、紫外线灭菌法 开紫外灯30~40分钟,基本上可达杀菌目的,距照射物的距离以不超过1.2米为宜。注意紫外线对人体有伤害作用,所以不能用眼睛直视开着的紫外线灯,也不能开着灯工作。

        4.1.4 母种分离

        即通常将食用菌的子实体、土壤中的菌根、菌素分离或进行耳木分离或孢子分离,然后在培养基上培养,得到母种。作为分离母种的种菇、种耳,必须从高产、稳产、适应性强的优良品系群体中,通过挑选、对照、评审,然后择优选取个体健壮,朵形圆正,外表清洁,无病虫害的种菇或种耳,作为分离的母体。具休分离方法有以下几种:

        ①、孢子弹射法 分离前把子实体用无菌水冲数遍后,用滤纸吸干表面水分。然后在接种箱或无菌室内。把种菇的菌褶朝下,用不锈钢丝勾住,悬挂在二角瓶内培养基的上方。勿使接触到培养基或四周瓶壁。瓶口用棉花塞紧。置于该菌适宜的温度下培养。一般12~20小时,菌褶上的孢子就会散落在培养基上,形成一层白色或其他颜色的粉未状孢子印。香菇、金针菇、银耳的孢子为白色,平菇极淡紫色,蘑菇、草菇为褐色。然后用无菌接种针沾取少量的孢子,在试管中的琼脂斜面培养基上接种待孢子萌发,生成菌落时,选孢子萌发早,长势好的菌落进行转管培养即得母种。

        ②、组织分离法 食用菌子实体,实质就是一团分化了的菌丝体,所以可从子实体中切取一小块放在培养基上培育,就可获得母种。这种分离法属于无性繁殖。具体操作:把经过筛选的优良品系的菇、耳子实体的组织块,作为分离材料。淋雨或吸水的种菇、种耳容易污染菌,一般不能作为分离材料。分离时,把种耳撕开,在菌盖和菌柄交界处或菌褶处,切取一小块组织作为接种物。银耳可以取耳片一点即可。为了减少带杂菌的机会,切取组织块时,应尽量小些,可得到的纯度高的菌种。然后接到斜面试管培养基的中央,在适宜的温度下培养,当组织块上长出菌丝,并向培养基上蔓延生长时,选择健壮、优良的菌丝体,移植到新的培养基上,进行扩大培养,即成为母种。

        ③、基内分离法 就是利用食用菌生育的基质作为分离材料,来得到菌丝体的一种方法。过去多用菇木或耳木的表面经过无菌处理,在该菌菌丝分布处切取接种块进行培养。近年来,银耳等均采用室内袋栽法。基内分离也就可以从栽培袋中挑选优良品系,割去子实体。取耳基作为分离材料。为了获得纯菌丝,先在袋内培养基的前端,挑取香灰菌丝少许,接入试管内培养。然后利用银耳菌丝和香灰菌丝的抗旱能力不同的特征,把分离材料进行风干或“迫干”脱水,然后剥取耳座内菌丝团,从中挑取灰白色粉状的菌丝体培养,得到纯白菌丝,再与香灰菌丝交合培养,即得母种。

        无论采用那一种分离法,接种后都应当把试管放在抱子萌发或菌丝生育的最适温度下培养。一般培养7~10天就可以看到芒状的菌丝,经过鉴别,如无杂菌,所得的菌丝即为纯菌种。

        4.1.5 母种转管扩大培养

        用上述方法得到的母种数量有限,往往不能满足生产上的需要,因而需要通过接种来扩繁一批母种供生产用。当分离的纯菌种转管接种后菌丝已基本布满斜面时,即可进行母种的转管扩大培养。选择菌丝健壮、生长旺盛无老化、无感染杂菌的母种试管,在接种箱内,用接种刀把试管内的菌丝体连同培养基切成2×3毫米的小块,随即接入若干支的试管培养基中央,塞紧棉塞。接种完毕后,将试管放于恒温箱内培养。一般每支母种试管可扩大繁殖30~40新管。

        转管接种操作要在严格的无菌条件下进行。其无菌操作要点如下:

        ①、将接种用母种试管和接种用试管夹在左手的母指和其他四指间。

        ②、右手拿接种刀,将接种刀置于酒精灯火焰内灼烧后,冷却1~2分钟。

        ③、将两支试管的棉塞用右手小指、无名指、中指夹住,慢慢拔下。然后将试管管口进行火焰灭菌并放在火焰无菌区内(一般在火焰上方3厘米和火焰周围1厘米范围内)。试管要与操作台面平行并稍向下倾斜。

        ④、将接种刀放入菌种试管内,把培养基分割成2毫米×3毫米小块,然后换用接种铲(灼烧,冷却),轻轻挑敢一小块菌种,马上抽出移入另一待接种的试管斜面培养基中央贴放好。

        ⑤、将试管口与棉塞轻轻进行火焰灭菌后,迅速把棉塞塞进试管。
      保藏的菌种在使用前,需先将菌种置于适温下,让其活化,然后及时使用转管,否则不易成活。转管应采用同一配方的培养基,可以收到较好的效果。

        4.2 原种操作规程

        原种也叫二级菌种,是由母种接种到瓶子或塑料袋里,经培养后得到的菌种。制作原种的目的,一是为了扩大种量,满足生产上的需要;二是让菌丝对各种秸秆类物质具有适应能力,并在适应的同时产生各种酶类;三是在培养过程中还可以对菌种的生命力、纯度等进行检验,存优弃劣。通过接种,一支母种可扩接3~5瓶原种。常见原种培养基配方:

        4.2.1 培养基制作

        ①、锯末培养基:锯末(阔叶树)78%、米糖(或麦麸)20%、糖(红糖或白糖,下同)1%、石膏粉1%,水适量。

        ②、棉子壳培养基:棉子壳78%、麦麸或米糠20%、石膏粉1%、糖1%,水适量。

        ③、锯末玉米粉培养基;锯末(阔叶树)90%、玉米粉8%、糖1%、石膏粉1%,水适量。

        ④、稻草段培养基:稻草段78%、米糠或麸皮20%、石膏粉1%、糖1%。

        ⑤、锯末、棉子壳混合培养基:锯末40%、棉子壳40%、麦麸18%、石膏粉1%、糖1%,水适量。

        ⑥、酒糟培养基:干酒糟40%、棉子壳(或锯末)40%、麦麸18%、石灰1%、糖1%,水适量。
        4.2.2 容器

        采用750ml的常规玻璃菌种瓶,玻璃瓶应保持清洁、干燥、无菌。

        4.2.3 装料

        装料时要随加随压实,松紧适度,上下均匀一致,四周无空隙,瓶肩装结实,一般装到瓶肩为宜(约350g),料装好后,用锥形木棒在瓶中央打一洞或用手指在中央摁一小洞穴,然后塞上棉塞,瓶口无空隙,松紧、高度适当,以单独提瓶瓶不掉下,棉塞碰不到料面为准。

        4.2.4 灭菌

        同4.1.3。

        4.2.5 接种

        灭菌后的料瓶放在干燥清洁,且通风条件好的室内冷却至10℃以下,放入接种箱内,用甲醛、高锰酸钾将料瓶外壁作杀菌处理。接种时,用接种铲将母种菌丝连同培养基切成25×200mm小段,每一小段接3~4瓶,接植于料瓶洞口,塞上棉塞。

        4.2.6 培养

        将接种后的菌种瓶立即放入温度控制在20~25℃、相对湿度70%左右的培养室内培养。在发菌培养阶段,菌种瓶必须竖放,待菌种萌发吃料后,可卧倒叠放,培养7~10天后检查有无杂菌;及时剔除,在整个培养过程中检查2~3次,直到菌丝长到瓶底,备用。

        4.3 栽培种操作规程

        4.3.1 培养基制作 同4.1.1。

        4.3.2 容器

        采用750ml的常规玻璃菌种瓶,水果罐头瓶,低压聚乙烯或聚丙烯塑料袋等。

        4.3.3 装料

        同4.2.3。

        4.3.4 灭菌

        同4.1.3。

        4.3.5 接种

        选择菌丝色白、生长有力、清晰、无杂菌的原种作为接种材料。接种时敲掉原种瓶底,用镊子夹取少量菌丝块,接在培养基洞口,每瓶原种接50~60瓶栽培种,离瓶口3~4cm处的砂厚种弃之不用。

        4.2.6 培养

        接种后菌种瓶整齐排放在干燥清洁的培养室内,温度一般控制在20~25℃,相对湿度为70%左右。5~7天后检查有无杂菌,之后每隔15天左右检查一次,直至菌丝长到瓶底,备用。

        5、菌种质量标准

        5.1 外观

        菌丝呈白色或灰白色,有线条状菌束,伸展整齐、健壮,不徒长,不结块,瓶肩处不退菌,瓶底不吐黄水,瓶口棉塞完整,不松动、不脱落。

        5.2 气味

        有鲜菇味,无其他异味。

        5.3 菌丝状态

        菌丝生长应均匀一致,无断裂、无萎缩及明显的菌丝退化现象,不应有黄斑状的菌丝或吐黄水现象或锈色水滴,摇动时无松动状,手感潮湿。

        5.4 杂菌、害虫

        菌种应无杂菌污染、无害虫滋生。

        5.5 适宜的菌龄

        栽培种菌龄一般75~100天(自接种到下种),时间过长会出现菌丝退化、吐黄水等现象。

        5.6 重量适当

        750ml的玻璃菌种瓶一般800~850克,过重则表明料太湿或装料偏紧,过轻则表明料偏干或装料过松,均不利菌丝生长。

        6、标志、贮存、运输

        6.1 标志

        出售的菌种必须贴有菌种质量合格标签,注明菌种种类、级别、品种、生产单位、接种日期。

        6.2 贮存

        6.2.1 母种保存方法

        可把试管放在室温15℃的室内保存,冬季应移入恒温箱内,防止受冻。此法适于草菇、银耳等在夏、秋季节生产的高温菌类。而香菇、平菇、蘑菇、朴菇、黑木耳等秋冬季节生产的菌种,可置于0~7℃的冰箱中保存。也可把试管口用腊封好后,再包上塑料薄膜,沉在清凉的井底保存。低温保存、每隔3~5个月就应转管移接一次,在适宜的温度下培养一星期,待菌丝基本布满斜面后,再放在低温中保存。

        6.2.2 原种保存方法

        原种连同菌种瓶用牛皮纸包好,放在4~14℃的温度下可保存工年左右。

        6.2.3 栽培种保存方法

        栽培种因运输、气候等原因,一时用不定,可暂时放在阴凉、干燥、通风、阴暗的室内保存。

        6.3 运输

        各级菌种不得在气温30℃运输,在运输中需要防震、防潮、防晒、防污染措施。

        附:

       食用菌卫生管理办法(卫生部)

        第一条 为贯彻预防为主的方针和执行《中华人民共和国食品卫生法(试行)》,加强食品卫生管理,提高食用菌的卫生质量,保障人民身体健康,特制订本办法。

        第二条 本办法管理范围系指蘑菇、香菇、草菇、木耳、银耳、鸡(土从)、猴头等鲜、干食用菌及其制品。

        第三条 为防治病虫害,使用药物消毒杀虫时,仅能用于菇房,并应严格掌握用量, 严禁使用1605、1059、666、DDT、汞制剂、砷制剂等高残毒或剧毒农药。

        第四条 栽培食用菌使用的材料,应报请当地食品卫生监督部门审查,符合卫生要求,方能生产、销售。

        第五条 食用菌制品,使用添加剂应符合现行的《食品添加剂使用卫生标准》。原料用水应符合现行的《生活饮用水卫生标准》。

        第六条 食用菌生产购销部门,必须加强毒菌、食菌鉴别知识的宣传,建立质量检验制度,对食用菌要做到专人负责,分类收购,严格检查,防止毒菌混入,严禁掺假、掺杂。

        第七条 食用菌的包装、贮存、运输必须符合卫生要求,严禁使用装过农药、化肥及具他有毒物质的容器包装,严禁与农药、化肥、中草药材和其他杂物混堆、混运。

        第八条 为了加强食品卫生管理,食品卫生监督机构可以向生产、销售等单位,根据需要按手续无偿采取样品检验,并给予正式收据。

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