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    食用菌菌种保藏的方法

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      食用菌菌种保藏的方法

        保藏食用菌菌种的方法很多,常采用控制温度、水活度、氧气和营养等因素的方法,最大限度降低或抑制食用菌菌丝体的生长从而达到菌种保藏的目的。首先要挑选优良的纯菌种,包括菌丝体和孢子;其次,根据其生理、生化特点,人为的创造低温、干燥或缺氧等条件,抑制菌丝体的代谢作用,使其生命活动降低或处于休眠状态,从而延长菌种生命以及使菌种保持原有的性状,防止变异。
        1 利用菌丝体保存的方法
        ① 琼脂斜面低温保藏 将要保藏的菌种接种在PDA斜面培养基上培养,在28~32℃下培养,待菌丝体长满斜面时,把试管的棉塞换成无菌橡皮塞,并用石蜡封口,置于4℃的冰箱低温保藏,每隔2~4个月转管1次。该种方法保藏的菌种不易老化,生命力强,接种后萌发快,能保持优良性状,但转接周期短,污染风险大,且菌株易变异,易造成菌株衰退。
        ② 液体石蜡常温保藏法 此法亦称矿物油保藏法。先将化学纯石蜡油(无色、透明的黏稠液体)装于三角瓶中,塞上棉塞并用牛皮纸包裹,放入高压锅中灭菌30min,然后置于40℃的恒温箱中,让水分蒸发至完全透明后备用,使用前先将石蜡油做无菌检查。在无菌条件下,用无菌吸管将无菌石蜡油注入已长好的斜面试管中,用量以高出斜面顶端1cm为宜,目的是使菌种与空气隔绝,阻止水分蒸发,降低细胞的生长代谢活动,然后用蜡封口后,直立放入室内干燥处。15~25℃,可以保藏菌种5年。该方法的优点是成本较低,保藏时间较长,长达数年甚至几十年;缺点是转接培养较慢,往往需要转接培养2~3次,才能除去菌丝体上的液体石蜡,使菌种恢复正常生长。
        ③ 蒸馏水保藏法 蒸馏水保藏方法适用于绝大多数食用菌菌种保藏。该法是用无菌蒸馏水保存食用菌菌丝体,过程为:用移液器吸取4mL无菌蒸馏水注入无菌安瓶中,将发育成熟的菌落用无菌接种针挑取数块放入安瓶中,加盖密封,室温保存。据报道,真菌用蒸馏水保藏可保存1~20年,而且菌株污染少。
        ④ 盐水保藏法 食盐溶液具有高渗透性,对杂菌孢子的萌发具有较强的抑制和杀灭作用,从而减少或避免保藏期间菌种的污染;同时,食盐中含有食用菌生长所必需的钠、镁、钙等金属离子,对菌丝的生长有促进作用,转管后,由于水势差,接种菌株吸水能力强,易恢复,成活率较高。以液体培养的菌丝体作为保藏体,用无菌盐水作为保藏液。将需保藏的菌种,接入PDA液体培养液中,震荡培养5~7d,将菌丝球移入装有5mL无菌生理盐水的试管中,每管接入4~5个菌丝球,塞上橡皮塞,并用石蜡封口,置室温或冰箱里保藏。
        2 利用孢子保存菌种的方法
        ① 滤纸片保藏法 取白色(收集深色的孢子)或黑色(收集浅色的孢子)滤纸,剪成4.0cm×0.8cm的小纸条,121℃下高温灭菌30min。真菌孢子采用钩悬法收集。将载有孢子的滤纸条放入无菌试管中,用白胶塞封口,再将试管放入干燥器中1~2d,除去滤纸水分,最后低温保藏。保存期可达2~10年。转接培养时,将滤纸条取出,放在适宜的培养基上培养,即可培养出所需要的菌种。
        ② 沙土管保藏法 取河沙用蒸馏水浸泡洗涤数次,过60目筛除去粗粒,加1%稀盐酸煮沸30min,再用水冲洗至pH达到中性,烘干备用。同时,取非耕作层的土壤,用蒸馏水反复冲洗至pH中性,烘干碾细,过100目筛,将处理好的沙、土按2~4∶1混匀,然后分装到小试管(0.5g每管),高压灭菌1h,待无菌检验合格后才可使用。将已形成孢子的斜面菌种,在无菌条件下注入无菌去离子水3mL,制成菌悬液,再用无菌吸管吸取菌液滴入砂土管中,以浸透砂土为止。将接种后的沙土管放入盛有干燥剂的真空干燥器直至沙土干燥。干燥的沙土管用无菌勺子捣松并每个菌种抽取1支接于斜面培养基上,进行培养,观察生长情况。检查无杂菌生长,则将制备好的沙土管用石蜡封口放入冰箱,在低温下可保藏2~10年。真空干燥操作须在孢子接入后48h内完成,以免孢子萌发。
        3 其它保藏方法
        ① 冷冻干燥保藏法 1945年Raper & Alexander首次报道应用冷冻干燥保藏产孢真菌,后来该方法被菌种保藏机构应用。这种方法是采用真空、干燥、低温等手段,使菌种新陈代谢活动处于相对静止状态,在低温下快速冷冻,又在低温下真空干燥,从而使菌种细胞结构与成分保持原来状态。对于真菌孢子来说,冷冻干燥是一种方便的长期保藏方法,但菌丝体不适宜该法保藏。目前,仅有Pertot等报道Claviceps spp.菌丝可经过冷冻干燥保藏后复活。
      该方法的过程是将安瓿瓶用2%的盐酸浸泡10~12h,用蒸馏水冲洗干净后再用蒸馏水浸泡至pH呈中性,干燥后置于高压锅灭菌45min,烘干备用。将已生长好的孢子悬浮于无菌的脱脂奶制成浓菌液,将菌液无菌操作分装于准备好的安瓿瓶中,每支安瓿瓶分装0.2mL。分装好的安瓿瓶放入低温冰箱中冷冻,然后将冷冻后的安瓿瓶置于冷冻干燥箱内,冷冻干燥8~20h后用真空泵抽真空,并在真空状态下熔封安瓿瓶。菌种冻干之后在4℃下可以保藏20多年。
        ② 液氮超低温保藏液法 1960年Hwang首次将此技术应用于真菌的保藏。根据液氮罐的构造类型,液氮超低温保藏液法可分为隔氮式和浸氮式。其中,隔氮式是将保藏物保藏于气相中,保藏温度一般在-135℃左右,而浸氮式是将保藏物保藏在液氮的液面之下,保藏温度为-196℃。
      液氮超低温保藏方法能使食用菌菌丝的一切生长代谢活动均停止,从而能避免菌种变异。液氮超低温保藏技术有3个关键因素影响真菌保藏效果,一是降温速率控制,理论上保藏前的降温速率控制越慢越好,1℃/min的降温速率适合大多数真菌的保藏。二是复活过程中保藏物是否能快速升温到最适温度,目前处理的方法是将保藏的冻存管快速置于37~45℃的水浴锅中,放置1~2min。三是保护剂的种类和浓度的选择,常用的保护剂有甘油、二甲基亚砜(DMSO)等。
        ③ 玻璃化技术 玻璃化保藏技术可能是食用菌菌种保藏的一个未来发展方向。玻璃化技术实质就是让水分子处于一种类似于固体状态而不发生结晶,可以通过空气干燥、化学物质干燥蒸发水分,渗透液脱水、海藻盐包装脱水、化学保护剂等手段实现玻璃化。通过玻璃化法降温保存细胞时,细胞内外的水都不形成冰晶,细胞结构不会受到机械损伤的破坏。此外,在恢复培养过程中应注意避免晶状体破碎和及时洗去对真菌有毒的玻璃化溶液。Ryan等报道了应用此法成功保藏一些真菌,如:Flammulina、Boletus、Mycena等属的一些菌种,而对Phytophthora、Saprolegnia保藏的检测结果是全部死亡,与常规应用的一些方法相比,高浓度玻璃化溶液对大多数真菌是有毒的,不利于真菌菌株的长期保藏。
        ④ 固定化技术 固定化保藏技术是将真菌菌株先包裹在藻酸钙中并进行超低温保藏的一种保藏技术。其基本过程如下,制备真菌孢子或菌丝的藻酸盐悬浮液;将藻酸钙溶液滴入藻酸盐的悬浮液,此时真菌孢子或菌丝体会包裹在形成的藻酸钙的小球中,放置一段时间;将菌丝或孢子小球转移到高渗溶液中进行脱水;最后按照真菌保藏的一些常规方法保藏菌种,如蒸馏水保藏、液体石蜡常温保藏、液氮超低温保藏等。Smith等建议该保藏技术可应用于一些担子菌、卵菌以及一些不产孢真菌的保藏。

        节选自《食用菌》:《食用菌种质资源菌种保藏方法研究进展》。作者:冯云利 郭相 邰丽梅 马明 桂明英(中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所,云南昆明 650221)

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