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    食用菌菌种保藏历史、现状及研究进展概述

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      食用菌菌种保藏历史、现状及研究进展概述*

      孔维丽,袁瑞奇,孔维威,张玉亭**,康源春,韩玉娥
      (河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所,河南 郑州 450002)
      《中国食用菌》2015.5

        摘要:从微生物菌种保藏的历史出发,简要介绍食用菌菌种现状、保藏现状、保藏任务等,重点介绍了食用菌菌株不同保藏方法的应用及研究进展,供广大读者参考借鉴。
        关键词:食用菌;保藏;研究进展

        世界各国非常重视微生物菌种的保藏工作,最早的菌种保藏工作从1890年开始,但直到1906年,各国才相继建立了菌种保藏机构。中国的菌种保藏机构始建于20世纪50年代,直到1979年正式成立6个专业性保藏管理中心[1]。随着食用菌产业的快速发展,中国已经成为世界食用菌种植和出口最大的国家之一,越来越重视对食用菌种质资源的收集与保藏工作。
        1 菌种保藏技术的发展历史
        微生物菌种资源保藏机构缘起欧洲,1890年捷克微生物学家F ran-tisek Kral 最早开始从事微生物菌种的公共性保藏[1]。菌种保藏的发展经历了两个大的阶段:微生物菌种保藏机构的兴起建设阶段和发展壮大阶段。20世纪初在巴黎、比利时、伦敦和日本等有关研究所相继建立了几个菌种保藏机构,延续至今的有1906年在荷兰建立的CBS(Centralbureau voor Schim-melcultures),1925年在美国建立的A TCC(America Type Culture Collection)。我国的菌种保藏机构始建于20世纪50年代。1979年在原国家科委的组织领导下,召开了第一届全国菌种保藏会议,成立了中国微生物菌种保藏管理委员会,正式建立了6个专业性保藏管理中心[1]。1963年国际微生物学会协会(International Association of Microbiology Societies)在渥太华召开国际菌种保藏会议,成立了“菌种保藏分会”(Section on Culture Collection)。1970年,在墨西哥城举行的国际微生物学会议上,将菌种保藏分会改组为世界菌种保藏联合会(World Federation for Culture Collections,简称WFCC),同时确定澳大利亚昆士兰大学微生物系为世界资料中心。WFCC成立之后,菌种保藏机构进入有序管理阶段,WFCC每3年~4年召开一次国际菌种保藏大会。该组织目前拥有601个保藏单位成员,分布在68个国家和地区。2004年~2010年第十届、第十一届、第十二届国际菌种保藏会议分别在日本、德国、巴西召开。2013年第十三届国际菌种保藏会议在北京召开,标志着我国菌种保藏技术手段达到世界领先水平。
        2 国内食用菌菌种保藏现状
        2.1 国内食用菌菌种现状
        2.1.1 种植品种多、范围广
        我国是世界上人工栽培食用菌最早的国家,食用菌种类繁多,野生食用菌数量超过2000种,驯化后的种类超过100种,商品化的种类超过60种。从1980年开始食用菌种植走向快速发展阶段,经过近30年大的发展已经逐步形成了不同特色区域:南方福建银耳、双孢蘑菇栽培,上海工厂化金针菇、真姬菇栽培,浙江香菇、双孢蘑菇等栽培;北方黑、吉、辽地区的黑木耳、滑子菇等栽培;中部地区山东、河南、河北、湖北、安徽的平菇、双孢蘑菇、香菇、毛木耳等栽培。中国食用菌种植规模和产量已经成为世界最大的国家之一,据2012年中国食用菌产业发展大会资料介绍,中国食用菌产量占到全球总产量70%以上,排名世界第一。
        2.1.2 品种乱
        实际生产中由于手工栽培者的不规范引用、自繁、代繁、串种,导致品种随意冠名,国内很多地方出现同物异名和同名异物现象,菌种质量下降,严重影响种植者的经济效益,成为制约我国食用菌产业发展的重要瓶颈问题。
        2.1.3 逐步走向规范化
        在各级政府、食用菌科技工作者的共同努力下,食用菌生产逐步向规范化方向发展。2006年,农业部颁布食用菌菌种管理办法,规范了食用菌菌种的种质资源、良种选育、生产与流通、质量与监督等的要求与管理[2]。在菌种保藏方面国内也逐步建立了知名的食用菌菌种保藏中心:中国农业微生物保藏中心食用菌分中心(上海市农业科学院)、农业部微生物肥料和食用菌菌种质检中心建立的国家食用菌标准菌株库(China Center for Mushroom Spawn Standards and Contorl,CCMSSC,挂靠中国农业科学院农业资源与农业区划研究所,是农业部认定的食用菌菌种保藏机构)、福建农林大学菌物中心(福建农林大学)、中国西南野生生物种质资源库(中国科学院昆明植物研究所)、福建三明真菌研究所、黑龙江省科学院微生物研究所食用菌研究中心(黑龙江省科学院微生物研究所)等。2002年起省级的菌种保藏中心也开始逐步建立:2002年山东省成立了食用菌菌种保藏中心,2010年河南省成立了食用菌菌种保藏中心。
        2.2 菌种保藏的重要性
        2013年WFCC第十三届国际会议在北京召开[3],中国科学院微生物研究所东秀珠说:“在微生物领域,不管是基础科研工作还是生物技术的应用研究,都需要保证菌种的质量和活力,这只有专业的菌种保藏中心才能做到;同时,保藏中心还要保持公益性,保证这些人类共有的财产能为所有人共享。此外,我们还要研究挖掘微生物的应用价值,让其不断“升值”,支撑起生物技术发展的源头。”
        2.3 菌种保藏的任务
        菌种保藏主要任务有4个方面:广泛收集在科学研究与生产中有价值的菌和菌株;研究生物学特性;研究和采取妥善的保藏方法,使菌种(株)不死,不污染,并尽可能少发生变异;编制菌种目录,为掌握和利用微生物资源提供依据。
        3 食用菌菌种保藏方法研究进展
        食用菌菌种的保藏方式总体分为2种:菌丝保藏法和孢子保藏法。菌丝保藏法在生产中最为常用,常见的有定期移植法、矿油封藏法、担子菌菌丝体液体保藏法、液态氮超低温冻结法、木屑保藏菌种、厩肥保藏蘑菇菌种、木块保藏法、枝条保藏法、甘油低温保藏法、麦粒保藏法。孢子保藏法因其方法相对复杂在生产中受到局限。孢子保藏法主要有沙土管法、L-干燥法、担孢子滤纸保藏法、冷冻真空干燥法。
        3.1 定期移植法
        定期移植法也叫继代保藏法。将保藏菌株接种于所要求的培养基上,在最适温度培养至成熟或产生孢子时,置入5℃的冰箱(或冷库)保存。在培养和保存的过程中,由于代谢产物的累积而改变了原菌的生活条件,结果菌落群体中的个体就不断衰老和死亡,因此每5天~15天或1个月~4个月重新移植一次,具体间隔时间因种而异。定期移植法适用于所有的食用菌,也是国内外保藏机构最常使用的方法。
        国内很多学者认为定期移植法培养易造成菌种退化,多用组织分离进行菌种复壮,保持原有的性状;而日本人认为从菇体中分离的菌株已不同于原菌株[4]。日本使用定期移植法保藏菌株20多年尚未见到菌种退化现象。肖奎等[5]利用I SSR分子技术实时监测、探索杏鲍菇继代保藏的极限时间,发现杏鲍菇4℃斜面保藏期限为180d,超过180d后杏鲍菇总产量和优菇率明显下降,因此杏鲍菇的保藏期限最好是3个月。不同菇类是否有不同的保藏期限,值得探讨研究。
        优点:适用于所有的食用菌,方法简单,设备价格低。缺点:需要经常转扩,工作量大,在转扩过程中存在不同菌株易发生混乱的风险。
        3.2 矿油保藏法
        矿油保藏法是法国人L umiere1914年发明,世界范围内广泛采用[4]。荷兰的C BS、日本采用此法保藏菌株。矿油保藏期限可在10年以上,一般为5年~7年。李钟庆等[6]用矿油保藏44属63种181株菌株,保藏期5年~8年;只有灵芝属3株、草地蘑菇8株保存5年~6年后失去活力,其余均保持活力。并对12株进行栽培试验,除假蜜环菌、香菇、银耳外,其余均保持形成子实体的性状。方法是液体石蜡高压灭菌1.5h,40℃恒温箱蒸发水分备用;PDA斜面培养基长满试管后,加入灭过菌的液体石蜡,高出斜面1cm为宜,竖直存放于阴凉干燥处。
        优点:操作简单,保存时间较长,省工,不需要设备。缺点:菌种需要垂直放置,占地面积大,运输不便,时间较长时面塞易沾染灰尘,污染。
        3.3 菌丝液体保藏法
        1939年Castellani[7]首次报道病原真菌蒸馏水保存技术(preservation in distilled water)后,该技术被广泛使用。刘风春等[8]用营养液(马铃薯20%、葡萄糖20%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%,硫酸铵微量,每支试管5mL)保存了36株担子菌,保存33个月和42个月后,经过培养试验表明,保藏33个月后,菌丝球存活率89.2%,菌块存活率91.9%,42个月后菌丝球存活率83.9%,菌块存活率88.9%,高于生盐水的存活水平(生理盐水33个月的存活率为70%),且此方法不影响子实体的结实能力。杨慧等[9]用蒸馏水保藏金针菇菌株12年,与液氮长期保藏的金针菇0188W、0188N菌株相比较,两者菌丝生长速度、生长势、纤维素酶活力差异不显著,而前者的菌丝满瓶时间和产量极显著高于后者。杨慧等[10]用蒸馏水保藏香菇菌株0338和0432发现:2种方法保藏的香菇0338菌丝生长速度无显著性差异,液氮保藏香菇菌种0432的菌丝生长速度显著地快于蒸馏水保藏方法保藏的菌种。方法是采用平板或三角瓶培养菌丝至长满,用打孔器在平板上打孔,取出5块~6块菌块或5个~6个菌球放入到试管内,加入灭过菌的蒸馏水、生理盐水或营养液,胶塞封口并蜡封。
        优点:操作简单,保存时间长,节省用工。缺点是:保藏试管需要直立摆放,空间利用率低。
        3.4 液氮超低温保藏法
        液氮保藏法是将保存的菌株密封于冻存管内,加入合适的冷冻保护剂,经预冷后,放入-196℃液氮罐内,达到长期保存的目的。液氮保藏适合保存各种微生物,同时国外制种商将其列为防止主要珍贵品种丢失的一项保险措施。液氮保藏菌株已经被世界各个保藏机构所采用,而对于其保藏效果的影响因素有不同看法:顾金刚等[11]认为降温速率控制、复活物快速升到最适温度、保护剂种类与浓度是液氮保藏技术的3个关键环节;韩芹芹[12]报道在液氮保藏过程中,保护剂和解冻方式对平菇菌株影响大于降温速度。刘新锐[13]认为降温速率、保护剂浓度、解冻速度、菌株菌龄、保藏基质均对保藏效果有影响。综上可以看出,液氮保藏法中保护剂在保存过程中是不可缺少的,降温速率以慢速降温较好,解冻温度在35℃~40℃之间,此外,出发菌株培养基的选择、菌株菌龄、保护剂种类的开发是今后研究方向。
        优点:此法保藏菌株时间长,可以长达5年~8年,不易退化。缺点:操作稍复杂,需要购买专用设备,定期加液氮,费用相对较高。
        3.5 木屑、木块、枝条保藏法
        木屑保藏法是最原始的保藏方式,同时也是生产中保藏木腐菌最有效的方法。木块保藏法是在木屑保藏的基础上有所改进。枝条保藏法是把保藏用的木块换成了枝条。霍红[14]报道利用木屑法保藏蜜环菌,可保藏1年~2年。戴晓东等[15]用木屑保藏法分别保藏黑木耳、榆黄蘑、猴头、滑菇、灵芝,10年后黑木耳菌株依然存活。方法是阔叶树木屑78%、麦麸20%、蔗糖1%、石膏1%,加水拌匀,分装于18mm×180mm试管内,至管内3/4处,高压灭菌40min备用。接种后28℃~30℃培养,当菌丝长至培养料的1/3,终止培养,用石蜡封口,防潮纸包好,4℃保藏1y~2y。启用时,将冰箱内取出试管放在8℃恒温箱中活化12h~24h,去掉表面老化菌丝,挑去木屑内新鲜菌丝接种即可。木块保藏法是选取黄豆粒大小木块,在1%糖水中内浸泡2h,然后按照木块80%、木屑20%比例混合培养料,使含水量达到60%,装入试管内,经高压灭菌接种。菌丝长满后,用石蜡封口,放置低温处保存。张雪岳[16]研究了枝条菌种保藏法,发现其适用于各种木生菌。何云松[16]研究报道了枝条法保藏红托竹荪,保藏期4年,菌株生长良好。方法是:在容器内(试管或者三角瓶)放入的木屑培养基,然后放枝条(枝条先浸泡),再加盖木屑培养基,盖过枝条顶部0.5cm,高压灭菌2h,冷却后接种,菌丝长满后,放在4℃或自然温度保藏,启用时,取出枝条,剥去树皮,将木块切成小块接种。
        优点:此法简单容易操作,省时省工。缺点是:占用地方大,只适合保藏木生菌,时间有限。
        3.6 甘油低温保藏法
        甘油低温保藏法的保藏温度介于普通冰箱与液氮保藏温度之间,保藏温度在-20℃~-70℃之间。阮秋菊[17]研究了在-70℃超低温冰箱保藏的5个金针菇菌种,以甘油作保护剂,保藏期为2年,结果显示在-70℃低温冰箱保藏2年后,菌种没有发生基因的变异,此报道只对金针菇有效,对其他菌株没有研究,因此在生产中还需进一步研究。
        优点:操作简单。缺点:保藏期限不确定。
        3.7 孢子保藏法
        孢子保藏由于其操作复杂,在生产中应用较少,科研机构应用较多,常见的有真空冷冻干燥法、担孢子滤纸保藏法。
        3.7.1 真空冷冻干燥法
        李造成[18]于1985年用此法保藏蘑菇孢子,在自然室温下,经过23个月,蘑菇存活率没有下降,经出菇试验,子实体性状没有改变。方苏等[19]研究了冻干法保藏冬虫夏草,结果发现虫草菌种以脱脂牛奶为保护剂,4℃预冷30min,然后于-20℃预冻2h,再于-80℃预冻24h的降温条件下,冻干机真空干燥后4℃保藏545d,菌株活化萌发长势好,5L生物反应器培养菌丝得率及主要有效成分虫草多糖、虫草酸含量均高于其他保藏方法。
        优点:保存时间长,不易退化,容易储存盒出售。缺点:操作复杂,需要专业设备。
        3.7.2 担孢子滤纸保藏法
        在第七届国际蘑菇科学会议上,T.W.Sinden在1932年收集的双孢蘑菇孢子保藏在滤纸片上,1968年检查,竟然存活,保藏期长达36年[4]。方法是滤纸剪成(2~3)cm×(0.5~0.8)cm的长条,平铺在培养皿内高压灭菌30min于烘箱内烘干,在试管内放变色硅胶1粒~2粒,加棉塞高压灭菌,80℃烘干1h,培养皿放置在孢子弹射器内,子实体八成熟,22℃~25℃培养1d~2d,孢子落在无菌滤纸上,滤纸放入小试管内,试管融封,置于1℃~3℃可以长期的保藏。
        优点:用此法保藏食用菌孢子,保藏时间长,便于运输。缺点:操作复杂,需要专用设备。
        4 食用菌菌种保藏效果评价方法
        对各保藏方法的保藏效果应从不同的角度进行综合评价。张金霞[21]分别从菌丝形态、菌丝生长速度、可溶性蛋白酶带、出菇等方面对草菇菌株的保藏效果进行了综合评价。蔡令仪等[22]从保藏方式对产量的影响方面进行试验研究。肖奎等[5]利用ISSR技术方法检测金针菇菌株保藏过程中菌株DNA图谱的变化。韩芹芹[12]报道了液氮保藏菌种对平菇菌丝体和子实体的影响。综合以上分析,食用菌菌种保藏效果的评价方法应该从微观形态和直观形态两个方面进行。直观形态包括:菌株的成活率、接种物存活率、菌落形态特征、产菇能力、子实体性状、生物学效率等。微观形态包括:酯酶同工酶谱和可溶性蛋白带的变化、DAN检测、菌丝、菌落形态(正常的菌丝一般具有透明、分枝状、有横隔和明显的锁状联合。仅有单核菌丝,不具结实性异宗结合的食用菌不宜作菌种;锁状联合多且密的双核菌丝结菇力强,一般是好菌种。在适宜的条件下,若菌丝长速正常、粗壮、浓密、整齐,一般为优质菌种)、相关酶活的测定(纤维素酶、漆酶等)、发酵产物的变化(虫草素、虫草多糖、香菇多糖等)等方面。

        参考文献:
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      链接
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        *基金项目:河南省现代农业产业技术体系(S2013-09);国家自然科学基金(31201670);河南省自主创新基金(2013JC20);河南省农业科学院科研发展专项(20137914);河南省科研开放合作项目(14216000055)。
        作者简介:孔维丽(1976-),女,硕士,助理研究员,主要从事食用菌栽培保藏技术研究工作。E-mail:kongweili2005@126.com
        **通信作者:张玉亭(1964-),男,硕士,研究员,主要从事食用菌栽培产业开发研究工作。E-mail:kyc_2725@163.com

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