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    文献:食用菌菌种质量检测技术

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      作者:黄志龙(福建省农业厅食用菌办公室 福建福州 350003) 中国食用菌,2006(5)

        农业部根据《种子法》制定的《食用菌菌种管理办法》,于2006年6月1日起施行。该办法从菌种场资质、生产经营到行政管理等方面对菌种质量要求都有十分明确的规定。但如何检测菌种质量。目前尚未统一检测技术,为贯彻实施《食用菌菌种管理办法》,笔者从多年的生产实践与管理过程中总结了一套菌种质量检测技术。现将该技术介绍如下:

        1 种性检测

        种性是指食用菌品种特性的简称。它由形态特征、生物学特性和农艺性状三个方面组成的。其检测内容分为形态学检测、生物学特性检测和农艺性状检测。同时,随着现代生物技术的发展。利用遗传学、同工酶和DNA指纹检测等技术也可以作为种性检测的重要手段。

        1.1 形态学检测

        1.1.1 菌落特征观察

        取待检菌种(母种、原种或栽培种,下同)通过转管活化后,再接种于平板培养基上。适温培养至菌落直径为培养皿直径的2/3时,观察菌落形态,主要包括菌落大小、气生菌丝和厚垣孢子等内容。同时,将该品种的标准菌株的菌种(以下简称标准菌种)设为对照,做同样处理,对比二者的菌落形态。如果菌落特征有差异。表明是不同品种;如果菌落特征没有差异。还不能判断是同一个品种。

        1.1.2 拮抗试验

        取待检菌种和标准菌种分别进行转管活化。在一个平板培养基上相距3cm左右接种。适温下培养。待两个菌落交接时进行观察。如果交接处出现明显的线状特征(有的食用菌出现栅栏状、有的出现不长菌丝的区带),即为拮抗。表明待检菌种与标准菌种是不同的菌株:如果没有表明出拮抗。待检菌种与标准菌种可能是同一菌株也可能不是。不能判断。

        1.1.3 菌丝显微观察

       在载玻片上滴一滴无菌水。用解剖针从待检菌种活化后试管内挑取少许菌丝于水滴上,撕散菌丝,盖上盖玻片。先用10倍物镜观察,再转到40倍物镜下观察菌丝的细微结构。尤其是判断是否有锁状联合、观察锁状联合的形态特征。测量菌丝细胞的宽度。同时。将该品种的标准菌种设为对照。做同样处理。对比二者的锁状联合的形态特征和细胞的宽度,如果有差异。表明是不同品种。如果二者没有差异。两者可能是同一菌株也可能不是。不能判断。

        1.1.4 子实体形态特征观察

      待检菌种与标准菌种在同样条件(相同的培养基、同时接种、同样环境下培养菌丝、同一菇房相近的位置)进行出菇。取各种发育阶段的子实体,肉眼观察其菌盖、菌褶、菌柄、菌环、菌托的形态特征、大小、长短、厚薄等。如果有明显差别,可以判断为不同品种。

        1.2 生物学特性检测

        1.2.1 温度

      取活化的待检菌种与标准菌株。分别接人相同的平板培养基(或斜面培养基)n个。放于适宜的温度下培养。当菌落直径1-2cm时。在菌落边缘画线作为生长起始线。随后把这些培养皿(或试管)分别置于5、10、15、20、25、30、35、40、45℃下培养。当生长最快的温度下的培养皿即将长满时取出,在菌落边缘再画一终止线。用尺子测量起始线与终止线之间的距离。计算菌丝生长速度,即可获得菌丝生长温度范围、最适生长温度。如果菌丝在某一温度下不生长。可以把这些培养皿再放到适宜的温度下培养。即可得出致死温度和限制生长温度(不生长但不死)。

        1.2.2 湿度

      取活化的待检菌种接人不同含水量(如45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%)的原种培养基上。置于适宜的温度下培养。当菌丝封面并长人料内2-3cm时。沿着菌丝前端画一条起始生长线后,继续培养,当快长满瓶时。再画一条终止线。用尺子测量起始线与终止线之间的距离。计算菌丝生长速度。即可获得菌丝生长适宜的含水量范围、生长最适含水量。

        1.2.3 酸碱度

        取活化的待检菌种接入不同酸碱度(pH1-11)的平板培养基上,置于适宜的温度下培养。当菌落直径1-2cm时。在菌落边缘画线作为生长起始线,继续培养,当快长满皿时,再画一条终止线。用尺子测量起始线与终止线之间的距离。计算菌丝生长速度。即可获得菌丝生长适宜的PH范围、生长最适pH。

        1.2.4 光线

        取活化的待检菌种接人相同的平板培养基(或斜面培养基)上,分成2份(其中1份用黑布遮光)。放于光照培养箱中。于适宜的温度下培养。当菌落直径1-2cm时。在菌落边缘画线作为生长起始线。继续培养。当快长满皿时,再画一条终止线。用尺子测量起始线与终止线之间的距离。计算菌丝生长速度,观察菌落特征。即可获知光线对菌丝生长的影响。

        1.3 农艺性状检测

        将待检菌种制成母种。再生产为原种。采用该品种适宜的培养基配方。制做袋栽45袋(床栽6m2)。接种后分3组(每组15袋或2m2)进行常规管理。在出菇阶段,作好每天的采收记录(重量、朵数。用于分析各潮菇的出菇时间、产量分布、转潮天数等),根据表1所列项目,进行适当的统计分析。整理成试验结果。同时将该品种的标准菌株设为对照,做同样处理。对比二者的检验结果,统计分析其差异显著性。

        1.4 现代生物技术检测

        1.4.1 遗传学检测

        收集待检菌种和标准菌种的担孢子。通常单孢分离获得单孢菌株。品种内单孢菌株之间进行配对。观察是否形成锁状联合。获得各种基因型的单孢菌株。待检菌种和标准菌种的单孢菌株之间进行配对。通过观察是否形成锁状联合。判断两个品种的不亲和性因子的基因型。如果2个品种的不亲和性因子基因型不同。则可以判断它们是两个不同品种。如果其基因型相同。则可能是相同品种也可能是不同品种,不能确定。

        1.4.2 同工酶检测

        从待检菌种的菌丝体中提取的粗酶液经电泳后。进行生物化学染色。同工酶的各组分会显示在凝胶的不同位置而形成同工酶酶谱。相同的菌种遗传背景相同,其同工酶酶谱也相同。常用于品种鉴别的同工酶有:酯酶同工酶、多酚氧化酶同工酶、过氧化物酶同工酶等。

        1.4.3 DNA指纹检测

        品种之间的种性差异是由于其DNA序列的差异。应用DNA检测技术判断待检菌种与标准菌种的DNA是否有差异。若有。则为两个不同的品种,若没有。则为相同品种。DNA指纹检测的方法很多。但归结起来不外乎寻找可应用于品种鉴别的特异DNA片段。即为分子标记。通过试验。检查两个品种所拥有的各种分子标记是否一样。从而作出判断。

        2 纯度检测

        纯度指菌种的纯化(净)程度。不能混有病毒、细菌、霉菌、螨虫、线虫等。除了用肉眼观察判断外。根据染杂对象不同采用以下相应的检测方法。

        2.1 病毒检测

        主要借鉴植物、动物病毒检测和酶联免疫法。具体做法:提纯待检菌种的病毒,用这种病毒免疫动物(如兔子),获得抗血清,应用抗原抗体结合的特异性及酶联显色技术进行检测,如果样品中存在病毒,则有颜色显现。

        2.2 细菌检测

        取少量待检菌种。按无菌操作接入营养肉汤培养液中,25-28℃振荡培养1-2d,观察培养液是否混浊。若培养液澄清,可初步判断为无细菌污染;若培养液混浊。可初步判断为为有细菌污染。为了进一步作出准确判断。可把培养液划线接种营养肉汤平板培养基,25-28℃恒温培养1-2d.观察是否有细菌菌落出现。

        2.3 霉菌检测

        2.3.1 培养基上霉菌检测

        用接种针取少量待检菌种疑有霉菌污染部位。按无菌操作接种于PDA培养基中。25-28℃培养3-4d,出现白色以外色泽的菌落、非待检菌种的菌落或有异味者为霉菌污染物。必要时可用显微观察方法进行观察判断。霉菌一般是低等真菌。没有锁状联合。

        2.3.2 棉塞上霉菌检测

        用酒精灯把露在试管口(或瓶口)外的棉花塞烧弃。用消毒过的镊子夹出剩余的棉塞。用接种针粘取棉塞底部。转入新鲜PDA斜面培养基。25-28℃培养3-4d后。按2.3.1方法进行判断。

        2.4 螨虫和线虫检测

        用接种针挑取取少许待检菌种的菌丝于载玻片上水滴中。撕散菌丝。盖上盖玻片。用lO倍或40倍物镜观察。检查是否有螨虫或线虫存在。

        3 活力检测

        活力指菌种的生活适应能力和抗逆能力。反映菌种的活力,如菌丝形态、发菌程度、色素、分泌物、菌丝自溶、拮抗线、原基、脱壁等。这些指标都可用肉眼来判断。还可以通过以下试验来检查菌种的活力。

        3.1 取待检菌种。按无菌操作要求。用接种铲或接种耙铲弃菌种表面(或斜面)一薄层,塞回棉花塞。放于适宜的温度下培养。观察其萌发出新菌丝的能力。

        3.2 取待检菌种。按无菌操作要求。接入下一级菌种培养基。适宜的温度下培养。观察其萌发出新菌丝及吃料的能力。

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