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    木耳菌种分离新方法简介

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      木耳菌种分离新方法简介

      杜萍1,2 崔宝凯1*
      (1 北京林业大学微生物研究所,北京100083;2 黑龙江农业经济职业学院,牡丹江157041)

        摘要 介绍了一种利用干耳组织分离木耳菌种的简便方法,分离效率高,操作时间短,节省材料,只需一小块耳片就能成功分离出所需菌种。

        关键词 耳片组织分离无菌操作

        近年来,随着山区开矿和城镇建没使木耳物种的数目日益减少,对木耳种质资源的收集、保存及研究成为一项必不可少的基础工作。而一株优良的木耳菌株经过多年的扩大生产使用,其优良特性会出现严重的退化现象,也必须进行重新分离复壮,为了保证木耳产业的正常发展,不间断地选育优良菌株势在必行。传统的选育菌种大多是通过组织分离方法,多用鲜耳直接分离或将干耳用水泡湿后再分离。目前也有采用干耳进行分离的,但程序繁杂,所用药品较多,条件差的地方难以做到。由于受多种药物的作用,即使分离成功,菌丝萌发和生长也很缓慢。黑木耳的耳瓣薄,并富有胶质,所以在过去的分离法中很少采用耳片组织分离。本方法克服现有的干耳菌种分离方法中所存在的操作复杂、成本高、菌丝分离成功率较低、质量差等缺陷,是一种操作简单,用材少(包括药品),成本低,菌丝萌发快,长势强,浓密,分离成功率高的干耳组织分离方法,以解决木耳的常规分离法所存在的一系列技术问题,为广大制种工作者提供方便。

        1 供试材料

        1.1 耳片来源

        2008年将从江西省分宜县大岗山、海南省陵水县吊罗山、海南省昌江县霸王岭、重庆市重庆师范大学、湖北省武汉市黄鹤楼景区、河北省涞水县北辛庄等野外采集的黑木耳[Auricularia auricula(L.ex Hook.)Underw.]、毛木耳[Auricularia polytricha(Mont.)Sacc.]及皱木耳(Auricularia deli~cata(Fr.)Henn.)标本带回室内自然阴干或于28℃的烘箱烘干,干燥后即可用于组织分离菌种。

        1.2 培养基制备

        ①、分离培养基:麦芽浸粉20g,琼脂18g,水1000mL,pH自然。将分离培养基煮好后趁热分装于5mL的离心管中,装液量为1.8mL,装于离心管架上,于121℃高压灭菌20min,灭菌后将离心管架倾斜摆放使培养基成一斜面备用。

        ②、纯化培养基:麦芽浸粉20g,葡萄糖20g,琼脂18g,磷酸二氢钾3g,水1000mL,pH自然。将纯化培养基煮好后趁热装于500mL的三角瓶中,用牛皮纸封口后于122℃高压灭菌20min。灭菌后趁热移至无菌超净工作台,分装于60gm×1.3cm的平皿中,装液量为13mL,将平板水平摆放,待培养基冷却后备用。

        2 组织分离方法

        2.1 材料准备 挑选朵型大、肉质厚、无筋或少筋、颜色正、无霉、无虫害野生或栽培的当年头茬干木耳1片放入无菌超净工作台内。每号标本准备10管斜面培养基。

        2.2 用具准备 组织分离所用工具为剪刀和镊子,使用前在酒精灯火焰上方消毒即可。

        2.3 组织分离及纯化培养

        2.3.1 干木耳消毒并润湿 在超净工作台内将干耳片表面用75%酒精棉球擦拭2~3遍,用酒精棉包住耳片约2min。

        2.3.2 剪取耳片组织块 用无菌剪刀将耳片四周边缘去掉,剪取远离耳基没有筋的最平部位的耳片,得到长0.5cm左右,宽0.2cm左右的组织块。

        2.3.3 组织块灭菌消毒 用无菌镊子夹取该组织块在酒精灯火焰的外焰上方来回快速穿梭2~3次,每次1~2s。

        2.3.4 分离培养 将组织块的1/3~1/2部位插入5mL离心管中的斜面分离培养基的中下部位之中;上述整个过程都要遵循无菌操作。将接种后的离心管插入离心管盒中(32管/盒),置于25℃恒温培养箱中培养。

        2.3.5 纯化培养 分离培养5~6d后,挑取新生长出的菌丝作为接种块接种于纯化培养基中进行纯化培养。

        3 结果与讨论

        组织分离2~3d后,长势旺盛的可看到白色绒毛状菌丝,分离成功率达95%以上。在用干耳组织分离过程中若出现污染也只是细菌污染,几乎没有霉菌污染,因此可在分离培养中添加100ug/mL的青霉素钠来增强培养基抗细菌污染的能力”。另外,转管时如不慎,挑取了染有细菌的菌落,转管后几天内细菌长势较旺,无法纯化菌丝。因此转管时应将接种块插入培养基(最好用平板)内部,接种块露出培养基表面1/3即可,这样细菌在培养基内生长,待其长出表面时菌丝的生长势已明显强于细菌,培养1周左右待菌丝长到无菌区再次转管可获得纯菌丝。

        试验采用的纯化培养基营养丰富,较适合木耳菌丝的生长,接种于60cm的平板培养基上,25℃恒温培养条件下生长势最强的菌丝6d就可长满平板,获得大量的木耳纯菌丝,菌丝生物量鲜重最高达到176.9mg/13mL,干重为70.8mg/13mL,长势中等的需10d,长势较弱的需10d以上长满平板。

        此方法与传统的木耳组织分离方法相比主要具有以下优点:

        ①、方法简便,节省材料,只需一小片耳片就能成功分离出所需菌种,又能较稳定地保持原有菌种的优良特性。

        ②、分离效率高,操作时间短,不需要用酒精或升汞等长时间浸泡处理木耳耳片,只需要将干木耳的表面用75%酒精棉球擦拭2~3遍,用酒精棉包住耳片约2min,然后将耳片组织块从酒精灯火焰的外焰中快速的来回穿梭2~3次,就能在较短的时间内达到彻底消毒的效果。而现有的木耳组织分离方法中多是采用升汞进行消毒处理,升汞对周围环境有害,对木耳也有一定的不利影响,用升汞消毒后需要用清水进行反复冲洗;但是干木耳如果润湿过度,将其剪成耳片组织块后,由于缺乏硬度和韧性,无法将其顺利插入到分离培养基中并保持竖立,结果造成分离成功率非常低。

        ③、耳片经晒干已杀灭部分杂菌,经上述再处理,消毒较为彻底,组织块接种在母种培养基上时,很快吸收无菌水分、使耳片膨胀恢复萌发菌丝能力,分离成功率高达95%以上(常规分离法最高的分离成功率仅为80%左右),菌丝生物量高。

        方法操作简捷,生产成本低,菌种分离成功率高,菌丝萌发快、长势强、浓密,适用于野生及栽培的黑木耳、毛木耳或皱木耳等多种胶质耳的组织分离,应用范围较广。

        参考文献

        [1] 戴玉成,图立古尔.中国东北食药用真菌图志[M].北京:科学出版社,2007:1-231.
        [2] 张丹,郑有良,高健伟,等.毛木耳(Auricularia polytricha)种质资源的ISSR 分析[J].山地学报,2006(增刊):142-148.
        [3] 郭翠英.干耳组织分离试验[J].江苏食用菌,1995,16(2):33
        [4] 刘光彦.一种快速简便的黑木耳组织分离新方法[J].贵州农业科学,2005,33(1):73.
        [5] 戴水莲,林警,高丽.PDA中加入抗菌素的抗菌作用试验[J].食用菌,2008,30(1):28-29.

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