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    菌种制作常见问题及其分析与处理

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      菌种制作常见问题及其分析与处理

        食用菌菌种制作过程中,只要规范操作,就能够生产出优良的菌种,优质菌种生产日显重要,菌种质量直接关系到整个生产的成败,劣质菌种所带来的损失也屡见不鲜。在生产实践中,我们常会出现一些意想不到的问题,影响菌种生产的如期完成,现就食用菌菌种制作及制作过程中出现的常见问题进行归纳及其分析处理,以便在生产中采取相应的技术措施。本文仅供参考。
        一、母种培养基凝固不良
        有时灭菌后培养基凝固不良,甚至不凝固。可以按以下步骤分析:先检查培养基组分中琼脂的用量和质量。如果琼脂没有问题,再用pH试纸检测一下培养基的酸碱度,看是否过酸,一般pH低于4.8时凝固不良。当需要较酸的培养基时(如猴头)可以适当增加琼脂的用量。
        二、接种物萌发不正常
        主要表现两种情况:一是不萌发或萌发缓慢;二是萌发出的菌丝纤细无力,扩展缓慢。
        如果母种自接种之日后,接种物一直不萌发,应先从转接母种上查找原因,检查其是否丧失活力。具体方法是:如果原来母种试管内还留有菌丝体,再转接几只试管,观察培养,最好使用和上次不同时制作的培养基。如果还是不长,表明母种已经丧失活力。如果第二次接种物成活了,表明第一次培养基有问题。在生产实践中,接种物全部不萌发的情况并不多见,但常有部分不萌发的事情发生,多发生于不耐低温保藏的某些种或品种,如红灵芝的一些品种,紫芝、毛木耳的一些品种,黑木耳杂交种等。
        如果原种和栽培种出现上述情况,应先检查培养温度是否适宜,培养温度也会造成上述情况的发生。如果培养温度适宜,要检查培养料的含水量是否过低。培养料含水量严重不足时,极易造成接种物不萌发。如果含水量适宜,就应从母种和培养基原料及灭菌效果上查找原因。分析的思路是:培养温度—培养基含水量—培养基原料质量—灭菌规程及效果—母种。对于接种物不萌发,或萌发缓慢,或扩展缓慢来讲,这几个方面的因素必有其一,甚至是多因子的不良影响。
        1、培养温度过高
        造成接种物不萌发,萌发迟缓。
        2、含水量过低
        尽管拌料时加水量充足,但由于拌料不均匀,造成培养料含水量的差异,含水量过低的菌种瓶或袋接种物常干枯而死。发生这种情况,及早补水尚可挽救。
        3、培养基原料霉变
        正处霉变期的原料中有大量有害物质,这些物质耐热性强,在高温下不易分解变性,甚至在高温高压灭菌后仍保留其毒性。接种后,菌种不萌发。具体确定方法是将培养基和接种块取出,分别置于PDA培养基斜面上,于适宜温度下培养,若不见任何杂菌,而接种块则可萌发、生长,即可确定为这一因素。
        4、灭菌不彻底
        主要是培养基内留有大量细菌,灭菌后残存的细菌分散在培养基中,无肉眼可见的菌落,而不像霉菌那样有肉眼可见的菌丝或分生孢子。多数食用菌在有细菌存在的基质中不能萌发和正常生长。具体检查方法如下:在无菌操作条件下取出菌种块和培养料,接种于PDA斜面上,于适温条件下培养,24—48小时检查,在接种物和培养料周围会有细菌菌落长出。
        5、母种菌龄过长
        母种和原种菌龄过长,菌丝活力会显著下降,作为菌种使用时萌发和长势会受到影响,因此,菌种生产者应使用菌龄适当的菌种进行菌种生产。多种食用菌母种使用最佳菌龄都在长满斜面后1~7天,栽培种生产使用原种的最佳菌龄在长满瓶(袋)14天之内,栽培种菌龄是自接种之日开始计算的。不同种类的食用菌栽培种生长速度不同,因此,最适菌龄也就不同。但是,无论长得快慢,都是长满后的7天内是使用的最佳菌龄。这一时期正是菌种的青壮年时期,菌丝分布均匀,细胞内营养物质积累充足,生命力旺盛,转接后吃料快。菌种长满后,随着培养时间的延长,菌种逐渐老化,培养基失水,菌种干缩,活力下降。因此。栽培种菌丝长满瓶(袋)后要及时使用。在计划周密的情况下,原种和栽培种生产的紧密衔接是完全可能的。
        三、发菌不良
        发菌不良的表现多种多样,常见的有生长缓慢、生长过快但菌丝稀疏、生长不均匀、菌丝不饱满、色泽灰暗等。
        母种发菌不良主要查找原因如培养基是否干涸,菌丝是否老化,品种是否退化等;培养温度是否适宜;棉塞是否过紧;空气中是否有有毒气体等。培养基不适、菌种过老、品种退化、培养温度过高或过低、棉塞过紧、透气不良、接种箱中或培养环境中残毒药剂过多都会造成菌种生长缓慢,菌丝稀疏纤细等。
        造成原种和栽培种发菌不良主要有以下几个原因:
        1、培养基酸碱度不适
        可将发菌不良的菌种瓶(袋)的培养基挖出,用PH试纸测试。
        2、原料中混有毒害物质
        多数食用菌原种和栽培种培养基原料主料是阔叶树木屑、棉籽壳、玉米芯、豆秸粉等,但若混有松、杉、柏、樟等树种的木屑,或贮存不当发生霉变,会显著影响菌种的生长。
        3、灭菌不彻底,有细菌残留
        培养基中若生长肉眼看不见的细菌,会严重影响菌丝体的生长。有的食用菌虽然料中残存有细菌但是仍能生长,如平菇,可见菌种外观异常,常表现为菌丝纤细稀疏、干瘪不饱满,色泽灰暗,长满基质后菌丝逐渐变得浓密。如果不慎将后期菌丝变浓密的菌种用于扩大栽培种将导致批量的污染发生。
        4、装料过紧
        培养料装的过紧时,透气性不足,不能满足菌种生长对氧气的需求。在这种情况下,可以采取打孔措施,增加料的氧气供给。具体措施是在无菌条件下用打孔棒将原有的透气孔由上至下扩穿一次,增加聊得透气性。
        5、水分含量不足
        水分含量过多过少都会导致发菌不良,特别是含水量过大时,培养料氧气含量显著减少,将严重影响菌种的生长。在这种情况下,往往长至瓶(袋)中下部后,菌丝生长变缓,甚至不再生长。含水量过少则生长显著减缓。
        6、培养室温度和湿度过高,空气流通交换不够
        当培养室温度高、空气湿度大、培养密度大的情况下,环境的空气自然对流和交换不足,影响菌种中氧气的供给,导致菌种缺氧,生长受阻。在这种情况下,菌种外观色泽灰暗,干瘪无力。
        四、杂菌污染
        这是菌人最头疼的问题,我们知道,在正常情况下,原种和栽培种的污染率应该在5%以下,各个环节和操作规范着,常只有2%以下。如果超过这一范围,则应该认真查找原因,造成菌种污染的原因大致有以下几个方面:
        1、灭菌不彻底
        这一原因导致的污染发生特点是污染率高,出现早,污染的不为不规则,培养物的上中下部位均出现杂菌。这种污染常培养3—5天就可出现。影响灭菌效果主要有以下几个因素。
        ① 培养基的原料性质
        不同材料导热性不同,其自然存在的微生物种类和基数不同。因此,灭菌时要根据培养基的不同掌握灭菌时间。常用的培养基灭菌时间的关系是木屑<草料(棉籽壳、玉米芯粉等)<木塞<粪草<谷粒,即木屑种需时最短,谷粒种需时最长。常压条件下灭菌粪草种或谷粒种培养基不提倡,因为很难达到灭菌要求,高压灭菌则具优势。
        从培养基的营养成分来讲,糖、脂肪、蛋白质含量越高,传热性越差,对微生物有一定的保护作用,灭菌需时相对要越长。因此,添加麦麸米糠较多的培养基灭菌也需时较长。
        从培养基的自然微生物的基数上看,微生物基数高,灭菌需时越长。因此,培养基加水配制均匀后,要及时灭菌,以免其中的微生物大量繁殖,培养基中微生物基数增加影响灭菌效果。
        ② 培养基的含水量和均匀度
        水的热传导性能较木屑、粪草、谷粒等的固体培养基要强得多,如果培养基配制时预湿均匀,吸透水,含水量适宜,灭菌过程中达到灭菌温度需时短,灭菌就容易彻底。相反,若培养基中夹杂有未浸进水分的“干料”俗称“夹生”,蒸汽就穿不透干燥处,达不到彻底灭菌的效果。培养基配制过程中要使水浸透料,木塞、谷粒、粪草应充分预湿浸透,以免“夹生”。
        ③ 培养料酸碱度
        由于氢离子有加快生命停止的作用,因此在材料和含水量相同的情况下,适宜偏酸性的木生食用菌生长的培养基比适宜中性或微碱性的草菇、双孢蘑菇等生长的培养基灭菌时间短。
        ④ 容器
        玻璃瓶较塑料袋热传导慢,在使用相同培养基、相同容量的料、相同灭菌方法时,瓶装种灭菌时间较塑料袋稍长,大袋较小袋灭菌时间长。
        ⑤ 灭菌方法
        高压灭菌和常压灭菌相比而言,高压灭菌可用于各种培养基的灭菌,而常压灭菌对于灭菌难度较大的粪草种和谷粒种达到完全灭菌效果就很不容易。
        2、封盖不严
        用聚丙烯塑料袋做容器时,经高温灭菌后比较脆,在搬运过程中,遇到一定强度的摩擦,折角处极易磨破,形成肉眼不易看到的沙眼。由此造成局部的污染。
        3、接种物带杂
        用于扩大繁殖的菌种本身是否是纯培养,无任何染菌,直接影响到接种后污染率的高低。如果接种物本身就已污染,扩大到新的培养基上必然出现成批量的污染,如一只污染过的母种接种扩接的4~6瓶原种全部污染,一瓶污染过的原种造成扩大的30-50瓶栽培种的污染。这种污染的特点是杂菌从菌种块上长出,污染的杂菌种类比较一致,并且出现早,接种后3-5天就可肉眼观察。
        这类污染只有通过种源的质量保证才能控制,这就要求作为种源使用的母种和原种在生长过程中要跟踪检查,及时剔除污染个体,在其下一级菌种生产的接种前再行检查,盐巴质量关。
        污染有两种情况,一是霉菌污染,二是细菌污染。霉菌污染比较易于鉴别,污染菌种的霉菌孢子几乎都是有色的,常见颜色有绿、灰绿、黑、黑褐、灰、灰褐、橘红等。有时霉菌污染后又被食用菌菌丝盖住,这种情况下仔细观察可以见到浅黄色的拮抗线。细菌则较难鉴别。细菌污染不像霉菌那样菌落长在表面,一看便知,而是分散在料内。有细菌污染的菌种外观不够白,甚至灰暗,菌丝纤细、较稀疏,不鲜活,常上下色泽不均一,上暗下白,打开瓶塞菇香味很淡。
        不管是原种还是栽培种,在栽培阶段发现培养基上、在菌丝生长的周围或斜面上部、低部、边缘出现乳白色、淡黄色、黑色或黏稠状的薄片或圆点状的菌落,这是被杂菌污染的现象,应及时淘汰,不能用于扩繁生产,以免给日后生产造成大面积污染。
        4、灭菌后接种前菌袋无菌状态的改变
        本来经灭菌的种瓶(袋)已经达到了无菌状态,但由于灭菌后的冷却和接种环境达不到洁净无菌,特别是简易菌种场和自制菌种的业户,达不到流水线作业专场专用,生产设备和生产环节分散,又往往忽视场地的大环境卫生,忽视冷却场的洁净度,使本已无菌的种瓶(袋)在冷却过程中就被污染。在冷却过程中,随着温度的降低,瓶内、袋内气压降低,冷却室如果灰尘过多,杂菌孢子基数就过大,杂菌孢子就很自然地落到了种瓶或种袋的表面而且随内外气压的动态平衡向瓶内、袋内移动,当棉塞受潮后就更容易先在棉塞上定植,或等待接种操作时碰触沉落进入瓶内或袋内。瓶(袋)外附有较多的灰尘和杂菌孢子时,成为接种操作的污染源。
        5、接种操作造成的污染
        接种操作造成的污染发生特点是分散出现在培养基上的表面,较接种物带菌和灭菌不彻底造成的污染发生稍晚,一般接种后7天左右。接种操作的污染源主要是接种室空气和种瓶、种袋冷却中附在表面的杂菌,有的接种操作人员自身洁净度不够,也是很重要的污染源,如违反接种操作规程,没有做到使用专用无菌的工作服,或工作服表面附有尘土和杂菌孢子,或手臂消毒不良等,都是接种操作的污染源。这些污染源的存在,都是接种操作的巨大威胁。
        6、培养环境不洁及高湿
        发生特点是,接种后污染率很低,随着培养时间的延长,污染率逐渐增高。这种污染多发生在接种10天以后,甚至培养基表面都已长满菌丝后贴瓶壁处陆续出现污染菌落。这种污染多方生在湿度大、灰尘多、洁净度不够的培养室。

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